酶法产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺重组大肠杆菌pepD/pepN基因的敲除及其发酵优化

刘沛沛，张震宇，孙付保，周豪

(江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)



酶法产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺重组大肠杆菌pepD/pepN基因的敲除及其发酵优化

刘沛沛，张震宇，孙付保，周豪

(江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)

摘要L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine, L-Ala-L-Gln)，是目前国内外公认的L-谷氨酰胺载体，在临床医学和营养学等领域有广泛应用。为了减少丙谷二肽在生物酶法生产过程中菌体对其降解，利用λ Red同源重组系统，敲除大肠杆菌中肽酶D和氨肽酶对应的编码基因。与野生型菌株相比，双敲除突变菌株的全细胞酶活提高了0.29倍。对该菌株进行摇瓶发酵优化，得到最优培养基为(g/L)：葡萄糖 12、酵母提取物 10、胰蛋白胨 10、(NH4)2SO4 1、KH2PO4 3、K2HPO4 1、MgSO4 0.2；最优发酵温度为27 ℃ ；最佳反应条件为：Gln 200 mmol/L 、Ala-Ome·HCl 200 mmol/L，反应pH 8.5，反应温度25 ℃。在最优条件下发酵36 h，丙谷二肽产量达到了14.51 g/L 反应液，是优化前的4.74倍。

关键词L-丙氨酰-L-谷氨酰胺；大肠杆菌；生物酶法；基因敲除；λ Red同源重组；发酵优化

L-谷氨酰胺(L-Glutmine,L-Gln)是一种条件必需氨基酸[1]，通常可由肌肉等组织大量合成，当人体处于外伤、手术或感染等应激或病理状态时，Gln的代谢加快，内源合成的Gln不能满足机体的需要，此时必须外源补充[2-3]。Gln具有维持胃肠黏膜正常组织结构[4]、提高机体抗氧化能力、增强机体免疫功能、抗肿瘤及抗抑郁性等重要生理功能[2]；在畜禽生产方面，适量的Gln可显著改善断奶仔猪腹泻[5-6]，减缓肉仔鸡老化速度并减少疫苗免疫对其的伤害[7]。……