耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌在EICU的临床分布及耐药性

张可,许秋然

(浙江省人民医院 急诊科，浙江 杭州 310014)

耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌在EICU的临床分布及耐药性

张可Δ,许秋然

(浙江省人民医院 急诊科，浙江 杭州 310014)

目的 探讨耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌在急诊重症监护病房(EICU)的临床分布及其耐药性的影响。方法 选取在2011年1月～2015年12月期间，浙江省人民医院定植或感染了耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌的重症患者为观察对象，对分离得到的耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌进行了分型、耐药性研究以及其奈唑胺耐药性的形成机理研究；并进一步研究耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌发病率与利奈唑胺使用量之间的关系。结果 在研究期间，共计有49例患者根据临床标本分离出耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌株系，其中表皮葡萄球菌有40株(81.6%)，人葡萄球菌有9株(18.4%)；药敏试验表明耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌对青霉素、左氟氧沙星、氨苄西林的耐药性达到了90%以上，对四环素、阿莫西林、红霉素的耐药性在60%以上；耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌在G2576T、L4、L5和L22区域出现突变的概率分别是87.5%、80%、50%和0；利奈唑胺使用量和耐利奈唑胺菌株发病率之间存在显著的相关性(R=0.293，P<0.05)。结论 耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌对多种常见抗生素具有耐药性，说明该类细菌的耐药性问题已相当严峻；同时利奈唑胺耐药性形成机理并不单一，细菌在G2576T、L4、L5和L22区域出现基因突变均可能形成利奈唑胺耐药性；利奈唑胺使用量和耐利奈唑胺菌株发病率之间存在显著的相关性。

利奈唑胺耐药性；凝固酶阴性葡萄球菌；急诊重症监护病房

为了探讨耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌在急诊重症监护病房(EICU)的临床分布及对其耐药性进行研究，本文对2011年1月～2015年12月期间从浙江省人民医院定植或感染了耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌的49例重症患者分离得到的耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌进行了分型、耐药性研究以及其奈唑胺耐药性的形成机理研究；并进一步研究耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌发病率与利奈唑胺使用量之间的关系。现将研究成果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取在2011年1月～2015年12月期间于浙江省人民医院定植或感染了耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌的49例重症患者(血液分布42例，尿分布6例，腹水1例)作为研究对象。其中男40例(81.6%)，女9例(18.4%)，年龄39～82岁，平均年龄(60.8±14.7)岁，住院时间19～63 d，平均(45.0±10.2)d；患者主要来源于急诊科(21例，42.9%)和内科(12例，24.5%)；入住急诊重症监护病房(EICU)的原因有呼吸衰竭(20例，40.8%)、休克(9例，18.3%)、多发伤(7例，14.3%)、中风(5例，10.2%)和其它(8例，16.3%)；在进行抗利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌分离研究的前1个月内，大部分患者都进行了一种或多种抗生素治疗，主要有利奈唑胺(43例，87.8%)，β-内酰胺类抗生素(42例，85.7%)、碳青霉烯类抗生素(27例，55.1%)。

1.2 方法

1.2.1 检测方法：按照传统微生物菌种分离和鉴定技术分离和鉴定所得的49种耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌菌株。根据《全国临床检验操作规程》进行药敏试验测定[6]，分别评估了耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌对青霉素、左氟氧沙星、氨苄西林、红霉素等10种常用抗生素的耐药性。此外，还通过cfr基因的PCR试验扩增了耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌rRNA 23S位点的V区域以及在核糖核蛋白L3、L4和L22区域的突变序列，并使用了DNASTAR软件进行了扩增序列的排序和分析。

1.2.2 评价标准：依据美国临床和实验室标准协会(CLSI)中的NCCLS标准判定药敏检测结果。根据美国胸科医师学会(ACCP)对于患者感染的严重程度进行评级：脓毒症、严重脓毒症和脓毒症休克。同时，对微生物学反应定义如下：根治型(在治疗末期培养结果为阴性)、持续型(在治疗期间培养结果为阳性)。

1.3 统计学方法 采用绝对频率和百分比进行定性变量描述，采用Kolmogorov-Smirnov(K-S)检验正态分布情况。组别之间的差异性检验采用Student’s t(T)法连续变量。当结果数据稀少的情况采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌分类鉴定结果 经过分离培养49株耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌分类鉴定结果显示：表皮葡萄球菌40株(81.6%)，人葡萄球菌9株(18.4%)。

2.2 耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌药敏试验结果 通过对49株耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌进行药敏试验测试，发现在常用的10种抗生素中，耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌对青霉素、左氟氧沙星、氨苄西林的耐药性达到了90%以上；对四环素、阿莫西林、红霉素的耐药性在60%以上；对万古霉素、利福平的耐药性在30%以上，对头孢呋辛、克林霉素的耐药性较低，见表1。由表1可知，目前耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌对多种常用抗生素具有普遍的耐药性，该类细菌的耐药性问题已经相当严峻。

表1 耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌对常用抗生素的耐药性研究Tab.1 The drug resistance of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci to common antibiotics

2.3 耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌耐药性形成机理研究 在耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌分离菌株中，共计有35.2%(6/17)的cfr基因表达为阳性。对2014年得到的8种耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌分离菌株进行了分子生物学研究，见表2。通过对rRNA 23S位点V区域上的基因进行排序和分析，发现共有7株菌株(87.5%)中存在G2576T突变，4株菌株(50%)在核糖核蛋白L3位置发生突变。同时，4株菌株(50%)在核糖核蛋白L4位置发生突变。没有菌株在核糖核蛋白L22位置发生突变，其中WT为野生型。

表2 耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌耐药性形成机理研究

从40株耐利奈唑胺表皮葡萄球菌菌株中选取7株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)的图形分析，见图1。从图1中可知，第1、2、3、4、6、7号菌株相互间具有同源性，第5号菌株与其余6株菌株不具有同源性。这表明大多数的耐利奈唑胺表皮葡萄球菌菌株之间具有遗传学相关性。

图1 耐利奈唑胺表皮葡萄球菌菌株PFGE分析结果Fig.1 The PFGE result of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci

2.4 利奈唑胺使用量与耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌发病率之间的关系研究 在研究期间，耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌患病数和利奈唑胺的使用量均逐渐下降，见图2、图3。从图2、图3可知：在2011年分离出11例，2012年17例，2013年14例，2014年3例，2015年4例，总共分离出49例耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌。在研究期间，利奈唑胺临床用率平均为12.2 DDDs/100住院天数。各年利奈唑胺临床用率(DDDs/100住院天数)分别为14.4(2010年)、13.8(2011年)、14.0(2012年)、11.6(2013年)、11.4(2014年)和8.1(2015年)。数据统计分析结果表明：在研究期间，利奈唑胺的使用量有显著下降(R=-0.378，P<0.05)。利奈唑胺使用量和耐利奈唑胺菌株发病率之间存在显著的相关性(R=0.293，P<0.05)。

图2 研究期间每年耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌患病数Fig.2 The prevalent cases of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci in each year during research period

图3 研究期间每年利奈唑胺使用情况Fig.3 The usage of linezolid in each year during research period

3 讨论

利奈唑胺是一种人工合成的唑烷酮类抗生素，在临床上普遍应用于治疗革兰阳性(G+)球菌引起的各种感染。尽管迄今为止，葡萄球菌对利奈唑胺的耐药比例依然很低。但国内外最新研究成果[7～8]表明：近年来，耐利奈唑胺的凝固酶阴性葡萄球菌发病率在不断攀升。因此，有必要对耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌对常用抗生素的耐药性展开研究。同时，虽然目前利奈唑胺的抗菌作用机制已经明确：利奈唑胺是一种细菌蛋白质合成抑制剂，通过与细菌核糖体RNA的23S位点相结合，阻止70S起始复合物的合成，从而抑制细菌蛋白质的合成[9]，但关于凝固酶阴性葡萄球菌耐利奈唑胺抗药性形成机理研究还十分不足。夏梦岩等[10]认为凝固酶阴性葡萄球菌具有耐利奈唑胺抗药性的主要原因是在rRNA的23S位点V区域发生了基因改变(主要为G2576T突变)，其次也可能为核糖核蛋白L3/L4位置发生基因突变。而Gu等[11]认为利奈唑胺耐药性形成机理也可能在于可转移的质粒载体核糖体甲基转移酶基因(cfr gene)。此外，利奈唑胺使用量与耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌发病率之间存在联系。Sanchez García等[12]认为利奈唑胺在临床应用中的增长在一定程度上导致了耐利奈唑胺的凝固酶阴性葡萄球菌的出现。

本文通过选取本院2011年1月～2015年12月定植或感染耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌的49例重症患者为观察对象，对分离得到的耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌进行了分型、耐药性研究以及其奈唑胺耐药性的形成机理研究；并进一步研究耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌发病率与利奈唑胺使用量之间的关系。结果显示，具有耐利奈唑胺的凝固酶阴性葡萄球菌主要由表皮葡萄球菌和人葡萄球菌突变形成；耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌对多种常用抗生素具有普遍的耐药性，说明该类细菌的耐药性问题已经相当严峻；耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌在G2576T、L4、L5和L22区域出现突变的概率分别是87.5%、80%、50%和0，这说明利奈唑胺耐药性形成机理并不单一；研究还发现，利奈唑胺使用量和耐利奈唑胺菌株发病率之间存在显著的相关性，利奈唑胺的使用量与耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌的发病率大体上呈正相关。

综上所述，目前研究表明耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌已经出现在急诊重症监护病房(EICU)中的危重患者当中。研究表明，利奈唑胺临床用量较低时能有有效降低耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌的发病率。因此，临床上应更加重视利奈唑胺的合理使用，尽量减少细菌对该类药物产生耐药性。

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(编校：王俨俨)

Clinical distribution and drug resistance of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci in EICU

ZHANG KeΔ, XU Qiu-ran

(Department of Emergency, Zhejiang People Hospital, Hangzhou 310014, China)

ObjectiveTo explore the clinical distribution and drug resistance of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci (CoNS) in intensive care unit (EICU).MethodsAn observational study was conducted in critically ill patients colonized or infected by linezolid-resistant CoNS in our hospital between from January 2011 to December 2015.The epidemiological and clinical features, and the mechanism of resistance to linezolid.The association between the incidence of linezolid-resistant CoNS strains and the consumption of linezolid in the study period were evaluated.ResultsDuring the study period, 49 patients had a linezolid-resistant CoNS strain isolated from clinical sample.Forty (81.6%) isolates were identified asS.epidermidisand nine wereS.hominis.The result of susceptibility testing indicated that linezolid-resistan CoNS had more than 90% resistant to penicillin, levofloxacin and ampicillin.Meanwhile, linezolid-resistan CoNS also had more than 60% resistant to tetracycline, amoxicillin and erythromycin.Molecular analysis confirmed the presence of mutation of G2576T, L3, L4 and L22 in 87.5%, 80%, 50%and 0, respectively, of the strains tested.Beside, a modest significant correlation was observed between the decrease in linezolid consumption and the lower incidence of resistant isolates.ConclusionLinezolid-resistant CoNS has resistant to many kinds of antibiotic.Meanwhile, molecular analysis confirms the presence of mutation of G2576T, L3, L4 and L22 of the strains tested, which confirms that different mechanisms of resistance to linezolid could coexist.Beside, a significant correlation is found between linezolid consumption and the incidence of linezolid-resistant CoNS strains.

linezolid-resistant; coagulase-negative staphylococci; emergency intensive care unit

张可，通信作者，本科，主治医师，研究方向：急诊内科，E-mail: 2832212851@qq.com。

R446.5

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.62