慢病毒介导siRNA靶向下调USP39表达对小鼠血管平滑肌细胞增殖及迁移的影响

何帅，尹力，钟伟，邱志兵Δ

(1.南京医科大学附属南京医院(南京市第一医院) 心胸血管外科，江苏 南京 210006；2.厦门大学医学院抗癌中心，福建 厦门 361102)

慢病毒介导siRNA靶向下调USP39表达对小鼠血管平滑肌细胞增殖及迁移的影响

何帅1，尹力1，钟伟2，邱志兵1Δ

(1.南京医科大学附属南京医院(南京市第一医院) 心胸血管外科，江苏 南京 210006；2.厦门大学医学院抗癌中心，福建 厦门 361102)

目的 探讨慢病毒介导siRNA靶向下调泛素化特异性蛋白酶USP39对小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及迁移能力的影响。方法 设计合成5组siRNA：对照组(siControl)、siRNAUSP39-70、siRNAUSP39-71、siRNAUSP39-72、siRNAUSP39-73，用慢病毒介导siRNA，转染小鼠血管平滑肌细胞VSMC，并用嘌呤霉素筛选稳转细胞。Western blot检测各组干扰效率，挑选出干扰效率最高的siRNA。细胞计数及MTT实验检测细胞增殖能力。Transwell实验检测细胞迁移能力的变化。结果 成功建立了稳定下调USP39的小鼠血管平滑肌细胞VSMC(siRNAUSP39-73组)。与转染空载的VSMC(siControl组)及空白对照VSMC(Normal组)比较，siRNAUSP39-73组USP39蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，细胞增殖及迁移能力均明显下降(P<0.05)。结论 靶向下调USP39蛋白能抑制血管平滑肌细胞VSMC的增殖及迁移能力。

慢病毒；USP39；血管平滑肌细胞；增殖；迁移

冠心病患者行冠状动脉搭桥术后面临血管的再狭窄，降低了手术远期效果。研究认为血管内皮细胞损伤，中膜平滑肌细胞增殖、迁移及细胞外基质大量积聚引起的内膜增厚和血管重构是移植血管发生再狭窄的主要原因。减少血管平滑肌细胞迁移和增殖是降低移植血管再狭窄发生的关键之一，但其机制尚不清楚，治疗手段也十分有限。去泛素化酶蛋白酶USP39是分子量65 kDa的U4/U6.U5三聚小核糖核蛋白体的剪接因子相关蛋白[1]。目前有限的针对USP39的研究显示USP39主要有以下功能：RNA的剪切[2-4]、维持纺锤体监测点的功能[5]、调节其他去泛素化酶的活性[6]、调节肿瘤的发生发展[7-8]。本研究组前期通过建立小鼠颈动脉狭窄模型和猪大隐静脉-颈动脉移植模型，证实了USP39蛋白在血管再狭窄模型中高表达(正在投稿中)。表明血管再狭窄可能与USP39的高表达对血管平滑肌细胞增殖及迁移有关。本研究拟用慢病毒介导的siRNA干扰技术靶向下调USP39表达，观察其对小鼠血管平滑肌细胞增殖及迁移能力的影响，探讨USP39在血管再狭窄中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 小鼠血管平滑肌细胞VSMC购自南京沐塞生物科技有限公司；293T细胞由厦门大学医学院抗癌中心实验室提供；siRNAUSP39-70、71、72、73质粒均购自上海吉凯基因，BCA蛋白浓度测量试剂盒，转染试剂Lipo2000、USP39抗体、二抗均购自美国Abcam公司，DMEM、opti-MEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素均购自美国Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：小鼠血管平滑肌细胞VSMC与293T细胞使用DMEM(含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素)培养基，于5%CO2、37 ℃条件下培养。

1.2.2 慢病毒介导的稳定下调USP39表达的小鼠VSMC的建立：设计并合成4组siRNAUSP39-70、71、72、73质粒(siRNAUSP39-70：GAATAACATAAAGGCCAAT；siRNAUSP39-71：CGGGTATTGTGGGACTGAA；siRNAUSP39-72：TTCCAGACAACT-ATGAGAT；siRNAUSP39-73：TTTGGAAGAGGCGAGATAA)，和siControl一起分成5组，从中筛选出敲低USP39表达效果最明显的质粒组。293T细胞培养至对数生长期，以每孔1×105个细胞接种于6孔板，长至60%密度时转染，转染试剂由Lipo2000脂质体(2.5 μL/μg质粒)+1.5 μg包装质粒+1.5 μg病毒载体+200 μL opti-MEM组成，转染12 h后换新鲜培养基，36 h后收取病毒液感染小鼠VSMC，并用polybrene增强转染效率，用嘌呤霉素(1 μg/mL)筛选2 w后，获得稳定干扰USP39表达的小鼠VSMC细胞。

1.2.3 Western blot对感染效率的鉴定：将感染48 h后的各组细胞(siControl、siRNAUSP39-70、71、72、73)胰酶消化后提取蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳后转印至硝酸纤维素膜，USP39一抗(1:1000稀释)4 ℃过夜，洗膜后二抗(1:100000稀释)孵育1 h，洗膜后显影，曝光。重复3次。

1.2.4 细胞计数实验：根据Western blot结果选择稳定下调USP39的VSMC系，为siRNAUSP组，同时设定siControl组及Normal组，将VSMC以1×104个细胞密度接种24孔板，培养箱内加入各组siRNAs之后培养72 h，用细胞计数器分别计数各孔内细胞数量。重复3次。

1.2.5 Transwell迁移实验：取对数生长期siControl组和siRNAUSP组VSMC。Transwell小室上室加入混有5 000个细胞的200 μL无血清细胞悬液，下室加入500 μL含10%胎牛血清的培养基，培养12 h后，取出小室，吸出培养基，PBS清洗3次，擦去小室内侧细胞，无水甲醇固定，晾干，结晶紫室温染色，PBS清洗3次，显微镜下每孔随机计数5个视野的穿过膜的细胞数并拍照，取平均值。重复3次。

2 结果

2.1 慢病毒介导的siRNAUSP39-73靶向干扰小鼠VSMC表达USP39蛋白 Western blot结果显示，siRNAUSP39-73组细胞的蛋白表达水平显著低于siControl组及其余siRNA组(P<0.05)，表明siRNAUSP39-73能靶向下调小鼠VSMC细胞的USP39的表达，且下调效果最好。见图1。

图1 各siRNAs组细胞USP39蛋白表达比较(n=3)**P<0.01,与siControl相比Fig.1 Comparison of USP protein levels among each group(n=3)**P<0.01,compared with siControl

2.2 USP39对小鼠血管平滑肌细胞增殖能力的影响 转染siRNAs 72 h后，VSMC细胞计数结果显示，siRNAusp39-73组细胞个数为34866±5201，显著低于正常对照组(47783±1818)和siControl组(47700±3488，P<0.05)。表明下调USP39的表达可以抑制siControl细胞的增殖能力。见图2。

图2 各siRNAs组VSMC细胞增殖能力比较(n=3)*P<0.05Fig.2 Comparison of VSMC cell proliferation ability among each group(n=3)*P<0.05

2.3 Transwell实验检测小鼠血管平滑肌细胞迁移能力 与Normal空白对照组和siControl组相比，siRNAUSP39-73组细胞的迁移能力明显减弱(P<0.001)，但Normal组与siControl组差异无统计学意义。见图3。

图3 各siRNAs组VSMC细胞迁移能力比较(n=3，×40)***P<0.001Fig.3 Comparison of VSMC cell migration ability among each group(n=3,×40)***P<0.001

3 讨论

血管再狭窄可能与炎症反应，内皮细胞损伤和血管平滑肌细胞的异常增殖、迁移及细胞外基质的大量聚积有关。有效抑制炎症反应，减少血管平滑肌细胞迁移和增殖是降低移植血管再狭窄发生的关键。血管平滑肌细胞在血管再狭窄形成中的作用一直备受关注。在静脉桥血管壁上多种细胞因子的表达包括ET-I、血小板获得性生长因子和成纤维细胞生长因子，基质蛋白的分解，都可促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移[9]。在其他已有的研究中也发现多种蛋白及基因与血管平滑肌细胞的增殖和迁移有关，如骨桥蛋白osteopontin[10]、periostin[11]、connexin 34[12]、microRNA-21基因[13]等，但关于USP39与血管平滑肌细胞之间的关系尚未有研究。

本课题组先前研究结果表明USP39蛋白在血管再狭窄模型中高表达，因此推测USP39极可能是与血管狭窄紧密相关的分子。USP39虽是泛素特异性蛋白酶家族的一员，但因为它缺少活性催化位点必要的氨基酸：半胱氨酸和组氨酸，导致其没有去泛素化酶活性。已有文献报道USP39在调控mRNA水平上起到重要作用，并在细胞有丝分裂过程中扮演重要角色[1]。Wang等[7]研究发现通过下调USP39的表达能诱导肺癌细胞凋亡。Wen等[8]发现去SUMO化的USP39蛋白能显著增强前列腺癌细胞的增殖能力。

本研究采用慢病毒介导的siRNA技术靶向下调VSMC细胞的USP39表达，Western blot结果显示该慢病毒载体系统可高效、稳定地感染小鼠血管平滑肌细胞。通过细胞计数和MTT实验证明siRNAUSP39-73组细胞的增殖能力较阴性对照组及空白对照组明显下降(P<0.05)。Transwell实验发现siRNAUSP39-73组细胞的迁移能力较对照组明显下降(P<0.05)。

综上所述，通过慢病毒介导的沉默USP39的表达能够显著抑制血管平滑肌细胞的增殖及迁移。USP39可能对血管成形术后血管再狭窄的发生及发展起到重要作用。下一步将对USP39影响血管平滑肌细胞增殖及迁移的调控机制及分子基础进行研究，以期为血管再狭窄的分子靶向治疗提供新的思路和治疗靶点。

[1] Hadjivassiliou H,Rosenberg OS, Guthrie C.The crystal structure of S.cerevisiae Sad1, a catalytically inactive deubiquitinase that is broadly required for pre-mRNA splicing[J].RNA, 2014,20(5):656-669.

[2] Lygerou Z,Christophides G, Seraphin B.A novel genetic screen for snRNP assembly factors in yeast identifies a conserved protein, Sad1p, also required for pre-mRNA splicing[J].Mol Cell Biol,1999,19(3):2008-2020.

[3] Makarova OV,Makarov EM,Luhrmann R.The 65 and 110 kDa SR-related proteins of the U4/U6.U5 tri-snRNP are essential for the assembly of mature spliceosomes[J].EMBO J,2001,20(10):2553-2563.

[4] Rios Y,Melmed S,Lin S,et al.Zebrafish usp39 mutation leads to rb1 mRNA splicing defect and pituitary lineage expansion[J].PLoS Genet,2011,7(1):e1001271.

[5] van Leuken RJ,Luna-Vargas MP, Sixma TK,et al.Usp39 is essential for mitotic spindle checkpoint integrity and controls mRNA-levels of aurora B[J].Cell Cycle,2008,7(17):2710-2719.

[6] Luna-Vargas MP,Faesen AC,van Dijk WJ,et al.Ubiquitin-specific protease 4 is inhibited by its ubiquitin-like domain[J].EMBO Rep,2011,12(4):365-372.

[7] Wan H,Ji X,Liu X,et al.Lentivirus-mediated inhibition of USP39 suppresses the growth of breast cancer cells in vitro[J].Oncol Rep,2013,30(6):2871-2877.

[8] Wen D,Xu Z,Xia L,et al.Important role of SUMOylation of spliceosome factors in prostate cancer cells[J].J Proteome Res,2014,13(8):3571-3582.

[9] Jeremy JY,Shukla N,Wan S,et al.The pathobiology of endothelin-1 in vein graft disease: are ETA receptor antagonists the solution to prevent vein graft failure?[J].Curr Vasc Pharmacol,2005,3(4): 315-323.

[10] Kang N,Ng CS,Hu J,et al.Role of osteopontin in the development of neointimal hyperplasia in vein grafts[J].Eur J Cardiothorac Surg,2012,41(6):1384-1389.

[11] Li G,Oparil S,Sanders JM,et al.Phosphatidylinositol-3-kinase signaling mediates vascular smooth muscle cell expression of periostin in vivo and in vitro[J].Atherosclerosis,2006,188(2):292-300.

[12] Han XJ,Chen M,Hong T,et al.Lentivirus-mediated RNAi knockdown of the gap junction protein, Cx43, attenuates the development of vascular restenosis following balloon injury[J].Int J Mol Med, 2015,35(4):885-892.

[13] McDonald RA,White KM,Wu J,et al.miRNA-21 is dysregulated in response to vein grafting in multiple models and genetic ablation in mice attenuates neointima formation[J].Eur Heart J,2013, 34(22):1636-1643.

(编校：吴茜)

Effects of lentivirus-mediated siRNA interference of USP39 on proliferation and migration of mice vascular smooth muscle cell

HE Shuai1, YIN Li1, ZHONG Wei2, QIU Zhi-bing1Δ

(1.Department of Cardiothoracic and Vascular Surgery, Nanjing Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Nanjing 210006, China;2.Cancer Research Center, Medical College of Xiamen University, Xiamen 361102, China)

ObjectiveTo investigate the effect of lentivirus-mediated siRNA interference of USP39 on proliferation and migration of mice vascular smooth muscle cell in vitro.MethodsFive siRNAs of siControl, siRNAUSP39-70, siRNAUSP39-71, siRNAUSP39-72 and siRNAUSP39-73 were designed and sythezied，mice VSMCs were infected with the lentivirus for delivering siRNAUSP39-73, and the stably transfected cells were selected by puromycin.The interference efficiency of siRNAUSP39-73 was assessed with Western blot.The effect of USP39 interference on the proliferation of VSMCs was determined by cells counting and MTT assay.Transwell assay was used to detect the migration of VSMCs.ResultsRecombinant lentiviral vector siRNAUSP39-73 was successfully transfected into mice VSMCs.Comparing with siControl group and Normal group, USP39 protein level of siRNAUSP39-73 VSMCs were decreased(P<0.05), and the proliferation and migration ability were all inhibited(P<0.05).ConclusionTargeted down-regulation of USP39 expression can inhibit the proliferation and migration of mice VSMCs in vitro.

lentivirus; USP39; VSMC; proliferation; migration

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.09

江苏省“六大人才高峰”B类(2014-WSW-052)

何帅，男，硕士在读；研究方向：血管成形术后血管再狭窄的治疗，E-mail：m15195851990_1@163.com；邱志兵，通信作者，男，博士，副主任医师、副教授，研究方向：血管成形术后血管再狭窄的治疗，左心辅助对终末期心衰的治疗，E-mail：qiuzhibing2009@163.com。

Q291

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