原癌蛋白MDM2分离纯化及结晶条件的初步筛选

王，齐心洁，郭红霞，刘，胡贤达，黄迎春Δ

(1.北京联合大学 生物化学工程学院，北京 100023；2.生物质废弃物资源化利用北京市重点实验室，北京 100023；3.中国藏学研究中心北京藏医院，北京 100029)

原癌蛋白MDM2分离纯化及结晶条件的初步筛选

(1.北京联合大学 生物化学工程学院，北京 100023；2.生物质废弃物资源化利用北京市重点实验室，北京 100023；3.中国藏学研究中心北京藏医院，北京 100029)

目的 探讨原癌蛋白MDM2分离纯化的条件，获得高纯度的目的蛋白，筛选该蛋白的结晶条件，获得MDM2蛋白结晶。方法 利用大肠杆菌表达系统，诱导表达MDM2蛋白，采用Ni-NTA亲和柱和分子筛对该蛋白进行分离纯化，通过圆二色光谱法对其二级结构进行分析，采用坐滴法对结晶条件进行初步的筛选。结果 获得了高纯度的MDM2蛋白，其二级结构有序，在低pH条件下有形成晶体结构的倾向。结论 MDM2蛋白结晶的最适pH为5.5，最适的MDM2蛋白质浓度为10 mg/mL。

MDM2；原核表达；分离纯化；结晶

抑癌基因的失活和原癌基因的异常激活通常会导致恶性肿瘤的发生。鼠双微基因 (Murine double minute 2，MDM2)基因是一个原癌基因，也是肿瘤抑制基因p53调控网络中重要的调节因子。其编码一个由491个氨基酸残基所组成的锌指蛋白[1]，能够作为E3泛素连接酶介导p53的降解[2]。此外，MDM2能够结合并掩盖p53的反式激活结构域，从而抑制p53的转录活性[3]。MDM2在体内与p53构成反馈体系，并与其他信号转导途径一起形成调控网络，参与肿瘤细胞周期调控、生长抑制、凋亡等过程[4]。MDM2的过量表达，与乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、人喉鳞状细胞癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、脂肪肉瘤、食道癌、骨肉瘤等多种肿瘤的发生有关[4]。

MDM2涉及的生理活性十分复杂，其相关信号通路并不明确，设计MDM2 抑制剂需要获得更加准确的MDM2蛋白结构与功能，其前提条件是需要得到高质量的MDM2蛋白结晶[5]。本实验室前期已对MDM2蛋白的表达条件进行了优化，本文旨在采用Ni-NTA亲和柱和分子筛对该蛋白进行分离纯化，并采用圆二色光谱分析及初步晶体学研究，为MDM2蛋白的结构与功能的深入研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒：含重组质粒pET28a-MDM2的大肠杆菌BL21感受态细胞由本实验室构建并保存。

1.1.2 药品和试剂：蛋白胨和酵母提取物购自英国Oxoid公司；IPTG和溶菌酶购自美国Merck公司；卡那霉素、Tris-HCl、四甲基乙二胺及十二烷基硫酸钠购自美国Amresco公司；β-巯基乙醇和磷酸盐缓冲液购自美国Invitrogen公司；蛋白标准品购自加拿大MBI Fermentas公司；蛋白质结晶条件筛选试剂盒分别购自北京博亚捷晶科技有限公司和美国Hampton公司，其他试剂购自北京化学试剂公司。

1.1.3 仪器：摇床购自上海和呈仪器制造有限公司；生化培养箱购自上海一恒仪器设备有限公司；高速冷冻离心机购自美国Thermo Fisher公司；超声波细胞破碎仪购自中国新芝公司；凝胶电泳系统购自北京君意东方电泳设备有限公司；FPLC系统购自美国GE公司；HPLC及检测系统购自美国Agilent公司；光学显微镜购自日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒pET28a-MDM2的原核表达:取2 μL重组质粒pET28a-MDM2转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，利用卡那霉素筛选阳性转化子。将长出的单菌落，接种至含有卡那霉素(100 μg/mL)的LB液体培养基中，在37 ℃下培养至OD600=0.6～0.8时，加入IPTG (终浓度0.2 mmol/L)进行诱导表达，15 ℃下继续培养20 h。用1 mL磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L，pH 7.0)漂洗菌体3次，加入溶菌酶溶液(pH 8.0 Tris-HCl 50 mmol/L，溶菌酶10 mg/mL)至终浓度100 μg/mL。室温放置15 min后，在冰浴条件下进行超声裂解操作。12000 r/min离心，分别收集上清液及细胞碎片沉淀，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

1.2.2 MDM2蛋白的分离纯化:将收集的细胞先用Buffer A(20 mmol/L Tris，0.3 mol/L NaCl，pH8.0)漂洗2次，每克湿菌体加3 mL Buffer A重悬，再加入上述溶菌酶溶液至终浓度100 μg/mL，室温放置10 min后在冰浴中进行超声破碎，功率设置为300 w，每次超声5 s，停7 s，重复50。20000 r/min下离心1 h，收集上清。将超声波破碎的上清全部缓慢通过Ni柱，再将Ni柱转移至FPLC仪器上分析，用Buffer B (20 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脱收峰，SDS-PAGE电泳分析。将收集目的蛋白通过分子筛凝胶过滤层析进行进一步分离纯化，使用GE公司Superdex 200 10/300凝胶过滤预装柱，通过Buffer C(200 mmol/L乙酸，200 mmol/L KCl，5 mmol/L β-巯基乙醇，pH 4.5)洗脱，收集目标蛋白并进行浓缩。

1.2.3 MDM2蛋白二级结构的圆二色谱测定:将经纯化的目的蛋白稀释至0.5 mg/mL，通过日本分光株式会社Jasco J-810圆二色光谱仪进行圆二色谱(circular dichroism，CD)扫描。扫描区域为远紫外190～240 nm，样品池光程为0.5 mm。CD谱测定在北京大学蛋白质和基因工程国家重点实验室完成。

1.2.4 MDM2蛋白结晶条件初筛:将纯化后的目的蛋白用截留相对分子质量为10000的超滤浓缩管浓缩，利用蛋白质结晶条件筛选试剂盒BCR 1-96、Index 1-96、Kit I 1-48、Kit II 1-48、Natrix 1-48、Wizard I 1-48、Wizard II 1-48、Wizard III 1-48共计480个条件，通过坐滴气相扩散法进行筛选。将蛋白溶液与池液在晶体板的样品槽内等比例混合，用透明胶条密封，置于16 ℃恒温室中，每5天通过显微镜观察蛋白液滴内晶体的生长情况。

2 结果

2.1 MDM2的原核表达 和未诱导的大肠杆菌BL21感受态细胞相比，经重组质粒pET28a-MDM2转化的感受态细胞在大约23 kDa处有明显的新增条带，与预测分子质量相符，说明目的蛋白MDM2在大肠杆菌中得到了高效表达。通过收集菌体并经超声破碎离心后的上清液与沉淀相比较，目的蛋白大量存在于上清液中，说明目的蛋白为可溶性表达。见图1。

图1 MDM2蛋白在大肠杆菌中的诱导表达的SDS-PAGE分析1: 蛋白质标准(M)； 2: 未诱导的全细胞；3: 未经破碎的全细胞；4，5: 细胞破碎离心后的上清液；6，7: 细胞破碎离心后的沉淀Fig.1 SDS-PAGE analysis of MDM2 protein expression in E.coli1: Standard protein (M); 2: Non-induced by whole cell; 3: Non-broken whole cell; 4, 5: Supernatant after centrifugation; 6, 7: Precipitation after centrifugation

2.2 MDM2蛋白的分离纯化 亲和层析纯化图谱显示，没有明显的单峰出现，见图2A。进一步采用SDS-PAGE，发现洗脱出来的蛋白虽然主要是目的蛋白，但是有较多的杂蛋白，见图2B。将浓缩得到的蛋白质通过Superdex 200进行凝胶柱层析分离，得到图2C所示图谱，结果发现目的蛋白洗脱峰不够规则，可能是蛋白纯度较低，也可能是蛋白质有聚集。

该蛋白是一个结合锌离子的酸性蛋白，因此优化分离纯化的条件为在Buffer A、B、C中分别添加了50 μmol/L ZnSO4，进一步降低分子筛洗脱液Buffer C的pH值至3.5(200 mmol/L 乙酸，200 mmol/L KCl，50 μmol/L ZnSO4，5 mmol/L β-ME，pH 3.5)。经Ni-NTA洗脱后得到了一个单峰(图2D)，收峰后通过高效液相色谱仪检测显示，经优化后的蛋白分离纯化方案所得到的目的蛋白纯度较高，几乎没有杂蛋白存在(图2E)。

图2 MDM2蛋白的分离纯化A：未经优化的MDM2蛋白Ni-NTA亲和层析图谱；B：未经优化的SDS-PAGE电泳图；C：未优化的MDM2蛋白粗提物分子筛图谱；D：优化的MDM2蛋白Ni-NTA亲和层析图谱；E：优化的MDM2蛋白分子筛图谱Fig.2 Purification of MDM2 proteinA: Ni-NTA affinity chromatogram of MDM2 protein without optimization; B: SDS-PAGE electrophoresis without optimization; C: molecular sieve map of MDM2 protein crude extract without optimization; D: Ni-NTA affinity chromatogram of MDM2 protein with optimization; E: molecular sieve map of MDM2 protein with optimization

2.3 CD分析MDM2蛋白的二级结构 Jasco J-810圆二色谱仪扫描显示，MDM2蛋白在远紫外200 nm处有明显单负峰，显示出明显的β-片层结构的圆二色谱特征吸收。见图3。在得到的MDM2蛋白的二级结构中，α-螺旋占20%以上，β-折叠占50%左右，其余大约30%为无规律卷曲。提示MDM2蛋白在水溶液中主要以β-片层的结构存在。

图3 MDM2蛋白的圆二色谱图Fig.3 Circular two chromatogram of MDM2 protein

图4 MDM2蛋白结晶条件的初筛A：澄清蛋白液滴；B：蜡状起泡沉淀；C：球状油滴；D：凝胶状蛋白液滴；E：变性蛋白沉淀；F：颗粒状沉淀Fig.4 Initial screening of crystallization conditions of MDM2 proteinA: Clear protein droplets; B: Waxy foam precipitation; C:Globular oil droplets; D: Gel like protein droplets; E: Denaturing protein precipitation; F: Granular precipitation

2.4 结晶条件的初步筛选 通过蛋白质结晶条件筛选试剂盒BCR 1-96、Index 1-96、Kit I 1-48、Kit II 1-48、Natrix 1-48、Wizard I 1-48、Wizard II 1-48、Wizard III 1-48对 MDM2蛋白进行了结晶条件的初步筛选，见图4。所得结果大致可以分为6类：澄清蛋白液滴(Index 17，pH 5.6，1.26 mol/L NaPO4·H2O，0.14 mol/L K2HPO4)；蜡状起泡沉淀(Wizard III 18，20%(w/v) PEG 6000，100 mmol/L 柠檬酸/ NaOH pH 4.0，1000 mmol/L LiCl)；球状油滴(Kit I 48，0.1 mol/L Tris-HCl pH 8.5，2.0 mol/L 磷酸氢铵)；凝胶状蛋白液滴(Index 46，0.1 mol/L Bis-Tris pH 6.5，20%w/v MPEG5000)；变性蛋白沉淀(Kit II 30，0.1 mol/L HEPES pH 7.5，10%w/v PEG 6000，5%v/v (+ / -)-2-甲基-2,4-戊二醇)；颗粒状沉淀(Index 7, 0.1 mol/L柠檬酸 pH 3.5，3.0 mol/L NaCl)。其中呈现A-C的条件，提示蛋白质在这些条件下处于溶解状态；呈现D-E的条件，提示蛋白质在这些条件下处于变性状态；而其中呈现颗粒状沉淀的条件，则提示有希望进一步优化获得可衍射的晶体。

3 结论

获得蛋白质结晶的首要步骤，是通过高效的蛋白质表达与分离纯化获得高纯度的蛋白质。蛋白质的纯度高与否决定了蛋白质能否长出晶体，也是蛋白质结晶中最关键的因素。本文在大肠杆菌中高效表达了人MDM2蛋白，并通过增加硫酸锌和降低pH的方法使MDM2蛋白成功纯化。在Buffer A(20 mmol/L Tris，0.3 mol/L NaCl，50 μmol/L ZnSO4，pH 8.0)、Buffer B(20 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，50 μmol/L ZnSO4，500 mmol/L咪唑，pH 8.0)、Buffer C(200 mmol/L 乙酸，200 mmol/L KCl，50 μmol/L ZnSO4，5 mmol/L β-巯基乙醇，pH 3.5)的条件下分离纯化MDM2蛋白，实验方法相对简单，稳定性较好，得到的MDM2蛋白纯度较高，符合结晶要求。

然而，蛋白质结晶条件的初步筛选并无规律可循。通常需要通过蛋白质结晶条件筛选试剂盒进行高通量的筛选[6]。本文采用了不同公司生产的8个试剂盒，共计480个条件，对MDM2蛋白的结晶条件进行了初筛。然而，在已采用的各种不同的结晶培养条件下，目前均未获得MDM2蛋白结晶。蛋白结晶的前体条件是纯度高于95%且均一度较高[7]，虽然已获得的蛋白纯度较高，且圆二色谱分析显示其二级结构有序(图3)，然而先前的凝胶柱层析显示洗脱峰较为杂乱(图2C)，提示有可能存在蛋白聚集等影响蛋白均一度的情况，这可能是导致无法结晶的原因之一。但本文中所示呈现颗粒状沉淀的条件(图4)，则提示有希望能够通过进一步优化，最终获得可衍射的晶体。因此在初步筛选到有利于结晶形成的条件的基础上，即MDM2蛋白结晶时使用的溶液的pH值应选择5.5、MDM2蛋白结晶较适宜的浓度为10 mg/mL，可以进一步优化结晶条件，从而得到MDM2蛋白结晶。

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[7] 戚宝杰，刘清海，谢静莉，等.变形杆菌属脂肪酶LipK107的分离纯化、结晶及初步晶体学分析[J].食品工业科技，2012，33(19)：201-204.

(编校：吴茜)

Purification and optimization of crystallization conditions of oncogenic protein MDM2

WANG Yue1,2, QI Xin-jie1,2, GUO Hong-xia1,2, LIU Yue1,2, HU Xian-da3, HUANG Ying-chun1,2Δ

(1.Biochemical Engineering College, Beijing Union University, Beijing 100023, China; 2.Beijing Key Laboratory of Biomass Waste Resource Utilization, Beijing 100023, China; 3.Beijing Tibetan Hospital,China Tibetology Research Center, Beijing 100029, China)

ObjectiveTo investigate and optimize the condition of purification and crystallization of oncogenic protein MDM2.MethodsMDM2 was expressed inE.coliexpression system, and purified by Ni-NTA chelating affinity chromatography and molecular sieve chromatography.The secondary structure of purified protein was analyzed by circular dichroism spectroscopy (CD).Then the crystallization condition of MDM2 was screened and optimized by sitting-drop vapor-diffusion method.ResultsHigh purity of MDM2 was obtained by Ni-NTA chelating affinity chromatography and molecular sieve chromatography purification.CD analysis indicated the secondary structure of MDM2 was ordered.Protein-crystallisation experiments illustrated that MDM2 was prone to crystallization under lower pH.ConclusionThe optimum pH of MDM2 protein crystallization is 5.5, the optimum protein concentration is 10 mg/mL.

MDM2; prokaryotic expression; purification; crystallization

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.10

王玥，女，实验师，研究方向：生物化学，E-mail:13581978641@139.com；黄迎春，通信作者，女，教授，研究方向：遗传学，E-mail:hyc@buu.edu.cn。

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