人参皂苷Rg1对实验性精索静脉曲张大鼠睾丸生精细胞凋亡及Bcl-2、caspase-3表达的影响

李洋洲，张大田

(1.锦州医科大学 研究生学院，辽宁 锦州 121000；2.锦州医科大学附属第一医院 泌尿外科，辽宁 锦州 121000)

人参皂苷Rg1对实验性精索静脉曲张大鼠睾丸生精细胞凋亡及Bcl-2、caspase-3表达的影响

李洋洲1，张大田2Δ

(1.锦州医科大学 研究生学院，辽宁 锦州 121000；2.锦州医科大学附属第一医院 泌尿外科，辽宁 锦州 121000)

目的 研究人参皂苷Rg1对精索静脉曲张(varicocele，VC)大鼠睾丸生精细胞Bcl-2、caspase-3表达的影响，探讨其对VC相关不育症的作用及机制。方法 选取Wistar雄性大鼠32只，随机分为4组：假手术组、VC组、低剂量人参皂苷Rg1组(5 mg/kg)、高剂量人参皂苷Rg1组(10 mg/kg)，每组8只。精索静脉曲张模型构建采用Turner法，造模4 w后，人参皂苷干预组分别灌胃不同剂量人参皂苷Rg1，假手术组及VC组灌胃等体积0.9%NaCl溶液，每天1次，灌胃4w后处死大鼠，切取左侧睾丸组织样本，分别采用TUNEL法、免疫组化法来检测细胞凋亡和Bcl-2、caspase-3的表达。结果 人参皂苷Rg1干预组大鼠睾丸组织Bcl-2的表达较VC组升高，低于假手术组，高剂量人参皂苷Rg1组Bcl-2的表达高于低剂量人参皂苷Rg1组(P<0.05)；人参皂苷Rg1干预组大鼠睾丸组织caspase-3的表达较VC组降低，高于假手术组，高剂量人参皂苷Rg1组caspase-3的表达低于低剂量人参皂苷Rg1组(P<0.05)；假手术组细胞凋亡指数最低，人参皂苷Rg1干预组细胞凋亡指数低于VC组，高剂量人参皂苷Rg1组细胞凋亡指数低于低剂量人参皂苷Rg1组(P<0.05)。结论 人参皂苷Rg1可显著提高睾丸生精细胞抑制凋亡因子Bcl-2的表达，同时下调凋亡执行因子caspase-3的表达，从而降低精索静脉曲张大鼠睾丸生精细胞凋亡。

精索静脉曲张；细胞凋亡；人参皂苷Rg1；Bcl-2；caspase-3

精索静脉曲张(varicocele，VC)是指精索内静脉因静脉回流障碍或解剖因素所导致的蔓状静脉丛的迂曲、扩张和异常伸长[1]。青壮年多发，轻者多无症状，重者引起阴囊坠胀或坠痛，甚至影响睾丸的生精功能，进而导致精液异常，是男性不育的主要原因之一。尽管对其致男性不育的机制已进行了大量相关的临床及实验研究，但具体的致病机制仍未完全阐明。精索静脉曲张可通过引起血管活性物质增加、睾丸微循环障碍、氧自由基增多、NO、缺氧、免疫异常及生精细胞凋亡等多种途径共同作用导致男性不育[2]。在细胞分子学方面的研究，主要集中在生精细胞凋亡。精索静脉曲张时抑制凋亡因子Bcl-2的表达减少，作为凋亡执行因子的caspase-3的表达增加，加剧了睾丸生精细胞的凋亡，从而造成生精功能障碍，影响生育能力[3]。

人参皂苷是人参内提取的一种固醇类化合物，是人参的主要活性成分，具有广泛的药理应用。近年的研究发现人参皂苷Rg1不但具有抗氧化、促进神经和血管再生等作用[4]，而且还具有抗细胞凋亡以及生精保护方面作用。微观上，人参皂苷Rg1可通过调节凋亡相关基因的表达、降低活性氧水平、抑制caspase-3的激活等途径，发挥抗细胞凋亡的作用。宏观上，人参皂苷Rg1能在一定程度上改善睾丸组织的结构损伤，从形态学上直观显示了其对睾丸组织有不同程度的修复作用，保护睾丸的正常生精功能[5]。本研究通过检测人参皂苷Rg1对VC大鼠睾丸组织Bcl-2和caspase-3的表达及对生精细胞凋亡的影响，旨在探讨人参皂苷Rg1对于VC所致生精细胞异常凋亡是否具有保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人参皂苷Rg1(纯度99%，购自上海融禾医药发展科技有限公司)，Bcl-2、caspase-3单克隆抗体和SP试剂盒(包含生物素标记二抗)、DAB显色剂(购自北京中杉金桥公司)，枸橼酸缓冲溶液(自配)，TUNEL检测试剂盒(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，自配)，苏木素和伊红染液(碧云天生物技术有限公司)。Leica组织切片机(德国RMZ125型)、DP72型光学显微镜(Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验大鼠的分组及处理、VC模型的构建 选择年龄为6 w的雄性Wistar大鼠32只(SPF级，购自锦州医科大学实验动物中心)，体质量150～200 g之间，随机分为4组：假手术组、VC组、低剂量人参皂苷Rg1组、高剂量人参皂苷Rg1组，每组各8只。制作实验性左侧精索静脉曲张大鼠模型。

模型制作采用Turner法[6]：10%水合氯醛(0.5 mL/100 g)腹腔注射麻醉，常规消毒铺巾。左侧腹直肌旁0.5 cm纵切口，逐层分离进入腹腔。向右侧推开腹腔内各个脏器，显露左肾静脉、肾脏、肾上腺静脉，于精索静脉内侧，将一根直径约0.55 mm的输液器针头与左肾静脉一起结扎，结扎不易过度用力，能顺利拔出输液器针头即可，拔出过程注意避免损伤周围血管及组织。1号丝线逐层缝合切口，腹腔内注射适量的青霉素溶液用以控制感染。假手术组只模拟手术过程，分离并显露左肾静脉，不予结扎。造模4 w后麻醉开腹，若左侧精索静脉明显扩张(直径大于0.1 cm)且两侧肾脏重量相似，则说明造模成功。整个实验中，造模手术过程大鼠死亡1只，术后饲养过程中死亡1只，造模失败2只，以上均使用备用大鼠随机增补至各组，最终有32只大鼠进入本实验。

造模4 w以后，各组大鼠分别作如下处理：①假手术组：0.9%NaCl溶液1 mL/100 g，每天1次，灌胃；②VC组：0.9%NaCl溶液1 mL/100 g，每天1次，灌胃；③低剂量人参皂苷Rg1组：人参皂苷Rg1 5 mg/kg，用0.9%NaCl溶液稀释至0.5 mg/mL，每天1次，灌胃；④高剂量人参皂苷Rg1组：人参皂苷Rg1 10 mg/kg，用0.9%NaCl溶液稀释至1 mg/mL，每天1次，灌胃；持续灌胃4 w后，4组大鼠均处死并切取左侧睾丸组织做后续处理。

1.2.2 HE染色 切取的左侧睾丸组织放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定，然后于酒精溶液内脱水、二甲苯溶液内透明，石蜡包埋，制作5 μm组织切片。常规HE染色。

1.2.3 Bcl-2、caspase-3表达的检测 各组睾丸组织的固定、取材、制片过程同上。免疫组化采用SP法来检测Bcl-2和caspase-3凋亡蛋白在睾丸组织中的表达，所有标本在同一条件下染色、DAB显色，Bcl-2、caspase-3单克隆抗体稀释倍数为1:100，以PBS缓冲液代替假手术组一抗。免疫组化阳性表达为细胞质或细胞核上出现棕色颗粒。用BI-2000医学图像分析系统测量和分析免疫组化灰度值，分析Bcl-2、caspase-3在大鼠睾丸组织中的表达，灰度值与阳性表达成正相关，即阳性表达越强则灰度值越大。

1.2.4 TUNEL法检测生精细胞凋亡指数 各组睾丸组织的固定、取材、制片过程同上。严格按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性。用光学显微镜计数500个细胞并计数其中凋亡细胞的数量。凋亡指数(apoptotic index，AI)定义为100个细胞中凋亡细胞的平均个数。

2 结果

2.1 HE染色 假手术组大鼠睾丸组织生精上皮结构完整，管腔内可见大量各级生精细胞，细胞间排列紧致有序；VC组大鼠睾丸组织染色可见生精上皮皱缩，支持细胞及各级生精细胞均显著减少，细胞聚集成团块状，生精小管管腔间隙增大；高剂量人参皂苷Rg1组大鼠睾丸生精上皮略变薄，支持细胞及各级生精细胞相对减少，细胞间排列较为稀疏；低剂量人参皂苷Rg1组的表现劣于高剂量组，但两药物组变化均较VC组轻。见图1。

图1 各组睾丸组织HE染色(×200)A：假手术组；B：VC组；C：低剂量人参皂苷Rg1组；D：高剂量人参皂苷Rg1组Fig.1 Results of HE staining in testicular tissue of rats in each group(×200)A:Sham operation; B:Varicocele model; C:Low-dose ginsenoside Rg1; D:High-dose ginsenoside Rg1

2.2 Bcl-2、caspase-3表达 在各级生精细胞细胞质和细胞核中Bcl-2、caspase-3均有表达，免疫组化阳性表达即为细胞质和细胞核出现棕黄色，以精母细胞最为明显，见图2、图3。人参皂苷Rg1干预组大鼠的Bcl-2表达高于VC组，低于假手术组；低剂量人参皂苷Rg1组大鼠Bcl-2表达低于高剂量人参皂苷Rg1组(P<0.05)。人参皂苷Rg1干预组大鼠caspase-3的表达低于VC组，高于假手术组；低剂量人参皂苷Rg1组大鼠caspase-3的表达高于高剂量人参皂苷Rg1组(P<0.05)。各组免疫组化平均灰度值见表1。

图2 各组睾丸组织Bcl-2表达(×400)A：假手术组；B：VC组；C：低剂量人参皂苷Rg1组；D：高剂量人参皂苷Rg1组Fig.2 Expression of Bcl-2 in testicular tissue of rats in each group(×400)A:Sham operation; B:Varicocele model; C:Low-dose ginsenoside Rg1; D:High-dose ginsenoside Rg1

图3 各组睾丸组织caspase-3表达(×400)A：假手术组；B：VC组；C：低剂量人参皂苷Rg1组；D：高剂量人参皂苷Rg1组Fig.3 Expression of caspase-3 in testicular tissue of rats in each group(×400)A:Sham operation; B:Varicocele model; C:Low-dose ginsenoside Rg1; D:High-dose ginsenoside Rg1

组别Bcl-2caspase-3AI(%)假手术组109.54±2.37137.04±2.957.10±2.80VC组128.86±2.56*117.39±2.92*20.28±0.69*低剂量人参皂苷Rg1组122.02±1.75*#124.42±0.86*#15.78±1.84*#高剂量人参皂苷Rg1组117.20±2.70*#△130.05±2.11*#△11.37±3.23*#△F值93.9199.2746.53

*P<0.05，与假手术组比较，compared with sham operation；#P<0.05，与VC组比较，compared with varicocele model post-treatment；△P<0.05，与低剂量人参皂苷Rg1组比较，compared with low-dose ginsenoside Rg1

2.3 TUNEL法检测结果 假手术组见生精小管内少量胞核呈棕色的凋亡细胞，主要是初级精母细胞；VC组可见管腔内各级生精细胞数量均减少，排列稀疏、紊乱，在各级生精细胞均可见胞核呈棕色的凋亡细胞；人参皂苷Rg1干预组的生精细胞排列较紊乱，细胞数略减少，可见散在棕色凋亡细胞，以初级精母细胞为主，见图4。人参皂苷Rg1干预组AI值均低于VC组，高于假手术组，高剂量人参皂苷Rg1组AI值低于低剂量人参皂苷Rg1组(P<0.05)。各组凋亡指数见表1。

图4 各组睾丸组织生精细胞凋亡情况(×400)A：假手术组；B：VC组；C：低剂量人参皂苷Rg1组；D：高剂量人参皂苷Rg1组Fig.4 Apoptosis of spermatogenic cells in testicular tissue of rats in each group(×400)A:Sham operation; B:Varicocele model; C:Low-dose ginsenoside Rg1; D:High-dose ginsenoside Rg1

3 结论

精索静脉曲张是青年男性人群中常见的一种泌尿生殖疾病，WHO把其列为男性不育的首要原因[7]。精索静脉曲张可通过引起血管活性物质增加、睾丸微循环障碍、氧自由基增多、NO、缺氧、免疫异常等多种途径共同作用进而导致男性不育，而上述这些途径均可间接或直接的诱发生精细胞异常凋亡[8]。细胞凋亡是多种内外因素激活细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡的过程，这一过程涉及很多基因的表达以及相互调控[9]，正常的机体活动中也存在细胞凋亡，这是机体维持内环境稳定的基本方式。在正常生精过程的各个阶段存在自发或诱发的生精细胞凋亡，以此来维持生精细胞和支持细胞间的适当比例，从而保证正常的生育能力[10]。精索静脉曲张发生时，多种内外因素可以直接或间接地诱发生精细胞发生异常凋亡，从而导致生精过程中精子生成减少，进而可能导致不育。Simsek等[11]的研究中，采用TUNEL法检测睾丸组织样本，结果显示VC组凋亡细胞的比率(14.7%)明显高于对照组(2%)。潘连军等[12]研究表明，VC大鼠的各级生精细胞的凋亡都有明显的增加，caspase-3的表达也明显升高，而且这种变化在对侧睾丸组织中也有呈现。成建军等[13]的研究显示，实验性左侧精索静脉曲张大鼠睾丸组织抑凋亡因子Bcl-2的表达随着VC持续时间的增加而减少，凋亡效应因子CytC、caspase-3的表达以及细胞凋亡指数都随着VC持续时间的增加而增加。综上可见，精索静脉曲张时抑制凋亡因子 Bcl-2的表达减少，作为凋亡执行因子的caspase-3的表达增加，从而加剧了睾丸生精细胞的凋亡，造成生精功能障碍，影响生育能力。本实验研究中也证实精索静脉曲张可降低Bcl-2表达(P<0.05)，提高caspase-3的表达(P<0.05)，进而影响生精细胞凋亡。目前对于精索静脉曲张致不育的机制已进行了大量的研究，但关于此药物治疗的研究报道却相对较少，而且作为主要手术疗法，对于精索静脉相关不育症的治疗效果并不理想，术后患者精液质量改善率仅有65%左右[14]，仍有相当一部分患者精液质量并没有明显改善，因此寻找一种药物来辅助或替代手术来治疗VC相关不育症成为临床需要。

人参皂苷Rg1是近年来相关领域的一个研究热点，是人参皂苷的主要活性成分之一，其不但具有抗氧化、促进神经和血管再生等作用，而且还具有抗细胞凋亡以及生精保护方面作用。张大雷等[15]研究表明人参皂苷可以通过抗氧化作用阻止生殖细胞的脂质过氧化和清除自由基并维持正常的抗氧化体系，从而保护氧化应激所导致的睾丸生精细胞的氧化损伤。许慧等[16]对人参皂苷Rg1及其代谢产物对生精保护作用的研究显示：人参皂苷Rg1可显著降低损伤睾丸组织的活性氧水平并能在一定程度上改善棉酚造成的睾丸组织的结构损伤，提示其对精子生成有明显保护作用，从形态学上直观显示了其对睾丸组织有不同程度的修复作用，从而保护睾丸的正常生精功能。Li等[17]、Cho等[18]研究证实人参皂苷Rg1可通过调制凋亡相关基因的表达、降低活性氧水平、抑制caspase-3的激活等途径，发挥抗细胞凋亡的作用。

本实验结果表明，人参皂苷Rg1可以显著提高睾丸生精细胞Bcl-2的表达，同时下调caspase-3的表达，减少精索静脉曲张所致的生精细胞凋亡，形态学上也直观地显示了其对睾丸组织损害的修复作用，对提高VC患者的生精功能有重要意义，也为临床探索VC相关不育症的治疗提供了新思路。该实验对人参皂苷Rg1对于VC所致的生精细胞凋亡是否具有保护作用及其机制进行了初步的探究，其具体药效浓度和作用时间还不十分确定，仍有待进一步研究。

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(编校：王俨俨)

Effect of ginsenoside Rg1 on spermatogenic cell apoptosis and expressions of Bcl-2 and caspase-3 in adolescent rats with experimentally induced varicocele

LI Yang-zhou1, ZHANG Da-tian2Δ

(1.School of Graduates, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, China; 2.Department of Urology, The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, China)

ObjectiveTo investigate the effect of ginsenoside Rg1 on the apoptosis of spermatogenic cell in rats with experimentally induced varicocele.MethodsA total of 32 adolescent male Wistar rats were included and randomly divided into 4 groups, including sham operation, left varicocele induced, left varicocele induced and low-dose ginsenoside Rg1(5 mg/kg), left varicocele induced and high-dose ginsenoside Rg1 (10 mg/kg), 8 rats in each group.The experimentally induced varicocele was established by Turner method.4 weeks after modeling, the two treatment groups

ginsenoside Rg1 of different dosages by gavage and sham operation and left varicocele induced group received the same volume of NS by gavage, once daily.4 weeks after gavaging, the rats were sacrificed then tissue from left testicle were taken, and the spermatogenic cell apoptosis was detected by TUNEL and Bcl-2 and caspase-3 expressions were detected by immunohistochemistry.ResultsThe protein level of Bcl-2 in ginsenoside Rg1 intervention group was significantly higher than varicocele group, and it was obviously higher in high-dose ginsenoside Rg1 group than low-dose ginsenoside Rg1 group (P<0.05).However, the expression of caspase-3 in ginsenoside Rg1 intervention group was significantly lower than varicocele group, but was higher than sham operation, the expression of caspase-3 in high dose ginsenoside Rg1 group was obviously lower than low dose ginsenoside Rg1 group (P<0.05).The apoptotic index was lowest in sham operation, and which was significantly lower in ginsenoside Rg1 intervention group than varicocele group, and the apoptotic index in high-dose ginsenoside Rg1 group was obviously lower than low-dose ginsenoside Rg1 group (P<0.05).ConclusionGinsenoside Rg1 could significantly reduce the testicular sperm cells apoptosis in experimental varicocele rats, raise the Bcl-2 gene expression and inhibiting the expression of caspase-3.

varicocele; apoptosis; ginsenoside Rg1; Bcl-2; caspase-3

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.11

辽宁省教育厅科学研究项目(L2014337)

李洋洲，男，硕士，研究方向：泌尿外科学，E-mail: 18841609821@163.com；张大田，通信作者，男，硕士，教授，研究方向：精索静脉曲张及肾癌，E-mail：jzzdt@sohu.com。

R697.24

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