葛根芩连汤对糖尿病大鼠早期视网膜病变影响的实验研究

刘亮

（辽宁中医药大学教师教学发展中心，沈阳　110847）

葛根芩连汤对糖尿病大鼠早期视网膜病变影响的实验研究

刘亮

（辽宁中医药大学教师教学发展中心，沈阳110847）

［目的］探讨葛根芩连汤对糖尿病大鼠早期视网膜病变的治疗作用。［方法］选取45只Wistar大鼠，链脲佐菌素（STZ）腹腔注射，制作糖尿病模型，糖尿病模型建立后随机分为DM组（糖尿病组）、DM+NS组（糖尿病生理盐水注射组）和实验组（DM+葛根芩连汤组）。模型建立后，DM组不做任何处理，实验组给予葛根芩连汤8.2 g/kg，DM+NS组注射等体积的生理盐水。对糖尿病大鼠的空腹血糖、血浆胰岛素、体质量、甘油三酯（TG）和高密度脂蛋白（HDL-C）的含量进行检测，以观察葛根芩连汤降糖降脂功效；通过免疫印迹（Westem blot）法检测视网膜蛋白激酶B（PKB）以及炎性相关因子——细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的表达情况；利用苏木-伊红（HE）染色观察各组大鼠的超微结构；采用TUNEL法检测凋亡相关蛋白C-myc的凋亡指数。［结果］与DM组和DM+NS组比较，实验组大鼠空腹血糖明显降低、体质量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与DM组和DM+NS组比较，实验组大鼠血胰岛素含量增加，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）；与DM组和DM+NS组比较，实验组大鼠TG明显降低而HDL-C明显升高（P＜0.05）。通过Westem blot检测可见与DM组和DM+NS组比较，实验组大鼠PKB的表达明显增加、ICAM-1的表达明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；光镜下HE染色观察到各组超微结构：DM组可见核固缩、浓染，核膜内陷，染色质边集，凋亡小体出现，实验组变化明显减轻（P＜0.05）；与DM组和DM+NS组比较，实验组中凋亡相关蛋白C-myc明显减少（P＜0.05）。［结论］葛根芩连汤能够改善大鼠空腹血糖、血浆胰岛素及体质量等的变化，具有较好的降糖降脂作用，能通过增加PKB的表达及抑制糖尿病大鼠视网膜病变的炎症反应减轻或延缓糖尿病的发生和发展。

葛根芩连汤；糖尿病；大鼠；早期视网膜病变；PKB；ICAM-1

中医学家张仲景在其《伤寒杂病论》中记载葛根芩连汤具有降糖和改善糖尿病病变程度的功效［1-3］。葛根芩连汤主治表证未解，邪热入里证，由葛根、黄芩、黄连和炙甘草4味中药组成。实验研究表明葛根芩连汤不仅能够降低多种糖尿病动物模型的血糖值，还能够改善糖尿病并发症［4-7］。葛根芩连汤各单味药及全方中，成分均较复杂，其含有小分子化合物及微米、纳米尺度的颗粒物质，能表现出不同的细胞活性［8-9］。本研究通过制作链脲佐菌素（STZ）糖尿病模型，探讨中医药在改善糖尿病大鼠血糖、血清胰岛素及血脂等指标中的作用，以期观察葛根芩连汤对糖尿病大鼠早期视网膜病变的治疗作用，为葛根芩连汤的应用提供实验依据，也为糖尿病视网膜病变的防治提供一种新方法。

1　实验动物与主要试剂

1.1实验动物健康SD大鼠45只，鼠龄为1月龄，雌雄不限，体质量（220～260）g，于恒温下饲养，自由饮水和进食，实验前1天禁食不禁水。实验中对动物处置方法符合动物伦理学要求。SD大鼠购自辽宁医科大学动物实验中心，动物质量合格证号：SCXK（辽）20050002。

1.2主要试剂STZ由北京北京莱博赛斯生物科技有限公司购进；甘油三酯（TG）测定试剂盒由美国Sigma公司提供；高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）与测定试剂盒（PTA-Mg2+沉淀法）均购自美国Santa cruz公司；TUNEL凋亡检测试剂盒购自大连宝生生物公司；罗氏血糖仪由北京赛百盛基因技术有限公司提供；Optium试纸（Abbott Diabetes Care Ltd）由美国SANTA公司产品提供，免疫印迹（Western blot）法反转录试剂盒购自TaKaRa公司；AMV逆转录试剂盒由杭州博日提供；ICAM-1抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；PKB抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；石蜡切片机购自北京天根生化有限公司；超净工作台由苏州安泰空气技术公司提供；眼科显微器械购自Thermo Forma公司；荧光倒置显微镜由德国Leica公司提供；葛根、黄芩、黄连、甘草购自北京同仁堂饮片有限责任公司提供。

作者简介：刘亮（1982-），男，硕士，主要从事中医内科学研究。

2　方法

2.1大鼠糖尿病模型制备及实验分组将45只SD大鼠给予高脂高糖饲料4周后，按45 mg/kg的剂量腹腔1次性经尾静脉注射STZ（用前溶于柠檬酸盐缓冲液，pH 4.5），注射后2周内用快速血糖仪连续2次、间隔至少2 d测大鼠尾端空腹血糖，血糖连续两次≥16 mmol/L，且出现多饮、多食、多尿表现，体质量减轻者为糖尿病模型成功。建立后采用随机数字表法分为DM组（糖尿病组）、DM+NS组（糖尿病生理盐水注射组）和实验组（DM+葛根芩连汤组）。模型建立后，DM组不做任何处理，实验组给予葛根芩连汤8.2 g/kg，DM+NS组注射等体积的生理盐水。

2.2各组糖尿病大鼠血糖、体质量、血胰岛素、TG 和HDL-C含量变化检测对大鼠体质量进行动态测定。隔夜禁食10 h后采用罗氏血糖仪进行大鼠尾端空腹血糖的检测。血胰岛素由辽宁医科大学动物实验中心生化室及核医学同位素室检测。抽取各组大鼠尾静脉血，离心后取血清，测定血清中TG和HDL-C的含量，方法见试剂盒说明书。

2.3Westem blot法检测蛋白激酶B（PKB）以及细胞间黏附因子-1（ICAM-1）的表达情况于显微镜下去除眼前节，然后小心分离视网膜，将视网膜组织放入1 mL EP管中，弃去上清，加入1 μL的苯甲基磺酰氟（PMSF）裂解液，摇匀置于冰上超声裂解，裂解30 min，4℃条件下14 000 r/min（r=8 am）离心5 min。磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞3次，提取总蛋白，应用BCA法测定蛋白浓度。吸取50 μg总蛋白，去离子水补至20 μL，入等体积2×上样缓冲液，以5%浓缩胶40 V衡压1 h，以10%分离胶60 V恒压3.5 h，湿转14 V恒压14 h，37℃下摇床封闭2 h，分别加入1∶1 000稀释的PKB及ICAM-1一抗4℃过夜，次日，膜用三乙醇胺缓冲盐水溶液（TBS-T）洗涤3次，每次10 min，洗膜后加入二抗放入1∶5 000 HRP标记的二抗及 GAPDH，37℃摇床孵育60 min。TBST洗膜5 min，4次。二甲基联苯胺（DAB）显色，实验重复3次。用超敏ECL法检测。最后暗室曝光X线片，冲洗胶片，Image-Pro Plus 8.0软件软件分析条带灰度值检测，PKB及ICAM-1与GAPDH的比值作为PKB及ICAM-1相对表达量。

2.4糖尿病大鼠的视网膜超微结构观察大鼠于乙醚麻醉状态下断髓处死，以碘酒3点位标记，迅速摘除眼球，清除眼前段组织，小心分离视网膜，将视网膜组织用4%戊二醛固定固定24 h，4℃保存，做石蜡切片，用二甲苯脱蜡后，依次浸入梯度乙醇（70%、80%、95%、无水乙醇）中进行脱水处理。然后用蒸馏水清洗切片2 min，放置于苏木素染液中浸泡10 min，再用蒸馏水清洗切片，随后浸入梯度乙醇，用伊红乙醇溶液染色后，通过二甲苯透明。树胶封片，放置于恒温箱中干燥后于显微镜下观察，并摄像。显微镜下每张切片于受损脑组织区取不重复的5个视野，观察各组脑组织病理学形态变化。

2.5TUNEL法检测凋亡相关蛋白C-myc的凋亡指数将石蜡切片脱腊后，用梯度乙醇进行脱水处理，采用PBS液清洗5min，用4%多聚甲醛固定细胞15 min，再经PBS液清洗2次每次清洗时间为5min，用20 mg/L Proteinase K通透细胞15 min，PBS浸洗5 min，浸入4%多聚甲醛固定5 min。加入100 μL的平衡液平衡10 min，于37℃下与TUNEL混和液反应60 min，经PBS清洗5 min共3次，加入DAB混合液避光显色，用苏木素复染后自来水冲洗，利用梯度乙醇脱水。采用二甲苯透明1 min，2次，中性树胶封片，拍照，显微镜下于每张切片选取5个视野（×400）计数500个细胞，求得阳性细胞百分率，计算细胞凋亡指数。

2.6统计学分析采用SPSS 18.0软件包进行处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示。比较治疗前后用配对t检验，组间比较采用单因素方差分析，重复测量设计采用重复测量方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3　结果

3.1各组糖尿病大鼠血糖、体质量、血胰岛素的变化给药后6周，与DM组和DM+NS组比较，实验组大鼠空腹血糖明显降低、体质量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。与DM组和DM+NS组比较，实验组大鼠血胰岛素含量增加，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

3.2各组大鼠TG和HDL-C含量变化比较给药后2周，与DM组和DM+NS组比较，实验组大鼠TG明显降低（P＜0.05）。与DM组和DM+NS组比较，实验组HDL-C明显升高，见表2。

3.3Westem blot法检测PKB以及ICAM-1的表达情况给药后2周，通过Westem blot检测可见与DM组和DM+NS组比较，实验组大鼠PKB的表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。与DM组和DM+NS组比较，实验组大鼠ICAM-1的表达明显下降（P＜0.05）。见图1。

表1　各组糖尿病大鼠血糖、体质量、血胰岛素的变化Tab.1　Changes of blood glucose，body weight and blood insulin of diabetic rats in each group

表2　各组大鼠TG和HDL-C含量变化比较Tab.2　Comparison of TG and HDL-C contents of rats in each group

图1　PKB与ICAM-1的表达情况Fig.1　PKB and the expression of ICAM-1

3.4糖尿病大鼠的视网膜超微结构观察给药后2周，对视网膜切片HE染色行超微结构的检查：DM组可见细胞水肿，核固缩、浓染，核膜内陷，染色质边集，可见大部分或全部的嵴消失，凋亡小体出现，部分双侧膜融合。DM+NS组：可见细胞质出现水肿，粗面内质网扩张明显，脱颗粒明显。与DM组和DM+NS组比较，实验组细胞水肿程度减轻，各种视网膜病变程度明显减轻（P＜0.05），见图2。

图2　各组大鼠视网膜形态学变化Fig.2　Morphological changes of the retina of rats in each group

3.5TUNEL法检测凋亡相关蛋白C-myc的凋亡指数TUNEL法结果可见，各组大鼠视网膜凋亡相关蛋白C-myc的表达变化比较，与DM组和DM+NS组比较，实验组中凋亡相关蛋白C-myc明显减少（P＜0.05）。表明糖尿病大鼠视网膜组织表达的C-myc可能参与了视网膜神经细胞的凋亡。C-myc凋亡指数的改变，可能与糖尿病视网膜病变密切关联。各组大鼠不同时间点C-myc的表达变化比较，见表3。

表3　各组大鼠C-myc的凋亡指数比较Tab.3　Comparison of C-myc apoptotic index of rats in each group

4　讨论

糖尿病作为一种复杂的代谢性疾病，常常会导致多系统、多脏器损害［10-12］。STZ诱导的大鼠糖尿病模型是目前公认的经典动物模型，此模型能够诱导出与人类2型糖尿病有许多共同特征的大鼠糖尿病模型，该模型选取的SD大鼠来源丰富，易于饲养，实验成本低，其视网膜血管与人类相似，可用于糖尿病视网膜病变的相关研究［13-17］。本研究以经典药方葛根芩连汤为研究对象，采取STZ模型，观察了葛根芩连汤对糖尿病大鼠视网膜病变的良好治疗效果［18-20］。

糖尿病视网膜病变的病因较为复杂，目前为止尚缺乏有效的治疗方法［21-22］。传统中医药治疗糖尿病视网膜病历史悠久，不良反应小，温和持久，且能很好的缓解并发症的发生［23-24］。有研究报道称葛根芩连汤有降低血糖及抗胰岛素抵抗作用，方中黄芩具有清肺胃实热、解血中糖毒作用，黄连具有清热燥湿、泄火解毒、治消渴病的功效，葛根中含有的黄酮类、生物碱类等化合物等具有调节糖代谢、调节脂代谢、改善胰岛素抵抗、改善氧化应激等疗效，甘草次酸、甘草黄酮抗氧化剂对胰岛β细胞具有较好的保护作用［25］。

另有研究发现［26-27］，葛根芩连汤能显著降低2型糖尿病动物的TG、TC、低密度脂蛋白等的水平。在潘竞锵的研究中，探讨了葛根芩连汤降低动物血糖的作用机制，研究结果证明了葛根芩连汤具有磺脲类药物和双胍类药物的降糖作用［28］。宋艳敏等［29］的研究证明了葛根素具有够保护糖尿病大鼠视网膜的作用。

本研究通过葛根芩连汤干预STZ模型视网膜病变，结果显示，与DM组和DM+NS组比较，实验组大鼠空腹血糖明显降低。与DM组和DM+NS组比较，实验组大鼠血胰岛素含量增加。与DM组和DM+NS组比较，实验组大鼠TG明显降低而HDLC明显升高。这些结果均证明葛根芩连汤可对糖尿病大鼠视网膜病变发挥较好疗效。通过Westem blot检测得知与DM组和DM+NS组比较，实验组大鼠PKB的表达明显增加、ICAM-1的表达明显下降，与DM组和DM+NS组比较，实验组中凋亡相关蛋白C-myc明显减少，因此推测葛根芩连汤可通过抑制炎症因子以及凋亡相关蛋白C-myc的表达从而抑制糖尿病大鼠视网膜病变的发展。光镜下观察到实验组视网膜超微结构病变明显减轻，提示使用此方能减轻视网膜超微结构的损害，延缓糖尿病视网膜病变的进程。

总之，葛根芩连汤能对大鼠糖尿病视网膜病变从多向性、多层面的发挥治疗作用，其所具有的优势是不可比拟的。相信随着对中药复方研究的深入，葛根芩连汤将会以其良好的临床疗效，逐步被广泛推广应用。但本研究仅做了初步的探索，还需要进一步的探讨研究来加以完善。

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（本文编辑：马英，滕晓东）

Experimental study of Gegen Qinlian Tang on the impact of early retinopathy in diabetic rats

LIU Liang
（Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China）

［Objective］To investigate the therapeutic effect of Gegen Qinlian Tang early stage of diabetic retinopathy in rats.［Methods］The 45 Wistar rats，streptozotocin（STZ）intraperitoneal injection，making diabetes were randomly divided into DM group，DM+NS group （saline injection group diabetes diabetic model）and the experimental group（DM+Gegen Qinlian group）.After modeling，DM group received no treatment，and the experimental group was given Gegen Qinlian 8.2 g/kg，and DM+NS group was injected with an equal volume of saline.Diabetic rats，fasting blood glucose，plasma insulin，body weight，triglyceride（TG）and high density lipoprotein（HDL-C）content were detected to observe Gegen Qinlian hypoglycemic lipid-lowering efficacy；by Western blot method retinal protein kinase B （protein kinaseB，PKB）and inflammation-related factors between a cell adhesion molecule 1（intercellular adhesion molecule1，ICAM-1）expression；HE staining used ultrastructure of rats in each group；with TUNEL assay of apoptosis-related protein C-myc in the apoptotic index.［Results］Compared with DM group and DM+NS，the experimental group was significantly lower fasting blood glucose，body weight increased significantly，statistically significant difference（P＜0.05）；the DM and DM+NS group，the experimental group of rats blood insulin content increased，the difference between groups was statistically significant（P＜0.05）；the DM and DM+NS group，the rats in the experimental group was significantly lower TG and HDL-C was significantly increased（P＜0.05）.By Western blot detection of visible and DM and DM+NS group，and PKB expression in rat experimental group increased significantly，and ICAM-1 expression was significantly decreased.The difference was statistically significant（P＜0.05）.HE staining was observed under light microscope ultrastructure groups: DM group pyknosis，stain，nuclear membrane retraction，chromatin margination，apoptotic bodies，changes in the experimental group was significantly reduced（P＜0.05）.The DM and DM+NS group，the experimental group of apoptosis-related protein C-myc decreased（P＜0.05）.［Conclusion］Gegen Qinlian Tang can improve fasting blood glucose，plasma insulin，and the change of body weight，with good blood glucose and lipids，by increasing the expression of PKB and suppress inflammation in diabetic rat retinopathy to reduce or delay the occurrence and development of diabetes.

Gegen Qinlian Tang；diabetes；rat；early retinopathy；PKB；ICAM-1

R774

A

1672-1519（2016）07-0425-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.07.11

2016-02-05）