榛花消肾安胶囊干预实验性糖尿病大鼠足细胞相关蛋白α-actinin-4的研究

赵承雅，韩香莲，南　征

（1.韩国；2.长春中医药大学，长春　130021；3.长春中医药大学附属医院，长春　130021）

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榛花消肾安胶囊干预实验性糖尿病大鼠足细胞相关蛋白α-actinin-4的研究

赵承雅1，2，韩香莲2，南征3

（1.韩国；2.长春中医药大学，长春130021；3.长春中医药大学附属医院，长春130021）

［目的］通过实验观察实验性糖尿病（DM）大鼠的肾脏及足细胞相关蛋白α-actinin-4的表达，表明“榛花消肾安胶囊”治疗糖尿病肾病的有效性。［方法］建立链脲佐菌素（STZ）诱导的实验性糖尿病大鼠模型分为DM模型组、对照组、中药组、西药组，中药组给予榛花消肾安胶囊，西药组给予厄贝沙坦片；检测空腹血糖、24 h尿微量白蛋白、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN），应用光学显微镜和透射电镜及免疫组化方法观察足细胞骨架蛋白α-actinin-4的表达；应用实时定量聚合酶链反应（PCR）技术检测α-actinin-4 m RNA表达。［结果］中药干预之后中药高、中、低剂量组及西药对照组尿量较DM模型组明显减少（P＜0.01）；中药各剂量组与西药对照组大鼠血糖均明显低于DM模型组（P＜0.01）；中药各剂量组和西药对照组大鼠α-actinin-4及mRNA含量均低于DM模型组（P＜0.01）。［结论］榛花消肾安胶囊能够降低实验性DM大鼠血糖、Scr、BUN，减少尿微量白蛋白的排泄，而改善肾功能；能够抑制实验性DM大鼠早期肾脏体积增大，而抑制α-actinin-4蛋白表达及其m RNA的表达。

榛花消肾安胶囊；糖尿病肾病；足细胞α-actinin-4

糖尿病肾病（DN）是临床上常见而严重的慢性微血管并发症之一，临床特征为蛋白尿漏出，肾功能进行性恶化，病理变化为肾小球滤过率改变，基底膜增厚，系膜细胞增宽，直至肾小球硬化，发展至肾功能衰竭。其发病率随着糖尿病患者数的增加，愈来愈高，严重威胁着人类的健康。DN的发病机制复杂而多，近几年来，很多研究表明，各种原因导致在肾小球滤过膜的足细胞损伤参与了糖尿病肾病产生发展中起很大的作用，因此对足细胞的研究进而改善足细胞功能的药物成为治疗糖尿病肾病的关注点。

导师南征教授认为“毒损肾络，邪伏膜原”理论是糖尿病肾病的主要病因病机，提出了“解毒通络，益肾导邪，疏利膜原”治疗思路与方法。榛花消肾安胶囊是南征教授常用的治疗糖尿病肾病的经验方，在临床上疗效显著。通过本实验观察实验性糖尿病大鼠的肾脏及足细胞相关蛋白α-actinin-4的表达影响，表明“榛花消肾安胶囊”治疗糖尿病肾病的有效性。

1　材料与方法

1.1实验方法将70只Wistar雄性大鼠按照随机数字表法分为正常对照组和模型组，适应性喂养1周。造模1 d前晚上8点到早上8点予将要造模的60只大鼠禁食而不禁水12 h。分批单次腹腔注射1%链脲佐菌素（STZ）（50 mg/kg），STZ溶解之后20分钟内用完。同时，正常对照组大鼠则腹腔注射等体柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。注射STZ 72 h后，尾静脉采血，测空腹血糖≥16.7 mmol/L则为造模成功，列入观察对象。实验动物分组及给药方法为将造模成功的大鼠随机分为糖尿病（DM）模型组，中药高、中、低剂量组（予榛花消肾安胶囊干预治疗），阳性对照组（予厄贝沙坦片干预治疗）。中药组予榛花消肾安胶囊混悬液灌胃，高、中、低剂量组分别以1，0.5，0.25 g/（kg·d）（相当于成人临床用药量的5、10、20倍）；阳性对照组予厄贝沙坦混悬液20 mg/（kg·d）灌胃；正常对照组及DM模型组予等体积蒸馏水灌胃。连续灌胃观察12周，每4周测尿微量白蛋白1次。

1.2标本采集

1.2.1血尿生化指标测定每4周用代谢笼收集尿量1次，计量，用离心机3 000 r/min离心10 min，分层后取上清液装入EP管中，-80℃冰箱中冻存，待检测尿微量白蛋白；每2周大鼠尾静脉采血，监测血糖；予40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射，腹主动脉取血，离心（3 000 r/min，10 min），分层后取血清分装入EP管中，-20℃冰箱中保存，待测血糖、血脂、肾功能。

作者简介：赵承雅（1987-），女，韩国，博士研究生，主要研究方向为中医药防治消渴合并症的研究。

1.2.2免疫组化迅速取出双肾，放置于生理盐水中冲洗，去掉肾包膜，滤纸吸干，左肾称质量，并切取一半置于10%中性福尔马林液中固定，待石蜡包埋，切片，进行苏木精-伊红（HE）染色及免疫组化。

1.2.3电镜右肾切取小块肾皮质，放置于2.5%戊二醛/0.1 mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH7.4）中固定，用于电镜观察。

1.2.4实时定量聚合酶链反应（PCR） 取1 μL提取的RNA，用NAnoDROP 2000进行提取RNA含量与纯度测定。提取组织的RNA为模板，用All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一链。已合成的cDNA第一链为模板，进行相关基因表达的实时定量PCR，根据PCR结果评价各个基因在不同分组内的表达。检测基因引物设计与合成根据检测基因序列，用PRIME blast工具进行引物网上设计，引物由北京欣博盛生物技术有限公司合成，每个引物为2OD，纯化级别为PAGE级。应用染料法，进行基因表达的实时定量PCR检测。采用的试剂盒为广州复能基因公司的All-in-OneTMqPCR Mix试剂盒。α-actinin-4的No.of Genbank为nm-031675.2，引物序列为上游：GGCTGAGAAGGGCTATGAAGAA，下游：AGAGCTTTGATGTCTGACAGGG，PCR产物长度为180bp。

1.3统计学处理实验结果采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析和重复测量方差分析，数据用均数±标准差（±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1肾质量/体质量、24 h尿量、空腹血糖比较实验结束时，中药各剂量组与西药对照组大鼠肾质量/体质量明显高于DM模型组（P＜0.01）。中药各剂量组及西药对照组尿量较DM模型组明显减少（P＜0.01）；中药高剂量组较西药对照组明显减少尿量（P＜0.01）。DM模型组、中药各剂量组、西药对照组大鼠血糖明显高于正常对照组（P＜0.01）；中药各剂量组与西药对照组大鼠血糖明显低于DM模型组（P＜0.01）；中药高、中剂量组空腹血糖明显低于西药对照组（P＜0.01）。见表1。

2.2肾功能实验结束时，DM模型组、中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）水平均高于正常对照组（P＜0.01）；中药各剂量组及西药对照组大鼠BUN、Scr水平均低于DM模型组（P＜0.01）。见表2。

表1　各组大鼠实验结束时肾质量/体质量、24 h尿量、空腹血糖比较（±s）Tab.1　Comparison of kidney weight/body weight，24 h urine volume，fasting blood-glucose of rats in each group after experiment（±s）

表1　各组大鼠实验结束时肾质量/体质量、24 h尿量、空腹血糖比较（±s）Tab.1　Comparison of kidney weight/body weight，24 h urine volume，fasting blood-glucose of rats in each group after experiment（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.01；与西药组比较，▲P＜0.01，△P＞0.05。

组别　动物数肾质量/体质量　24 h尿量　空腹血糖正常对照组　9　3.25±0.08　12.11±1.70　5.43±0.64 DM模型组　7　6.30±0.13*　100.36±15.57*21.40±2.49*中药高剂量组　8　4.29±0.11*#▲　39.25±3.24*#△12.84±1.14*#△中药中剂量组　8　4.63±0.17*#　58.75±5.31*#▲15.38±0.50*#△中药低剂量组　8　5.24±0.20*#　67.88±4.26*#17.48±1.03*#▲西药对照组　8　4.30±0.05*#　53.19±3.44*#17.31±1.21*#

表2　各组大鼠实验结束时肾功能比较（±s）Tab.2　Comparison of the kidney function of rats in each group after experiment（±s）

表2　各组大鼠实验结束时肾功能比较（±s）Tab.2　Comparison of the kidney function of rats in each group after experiment（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.01；与西药组比较，△P＞0.05。

组别　动物数　BUN（mmol/L）　Scr（μmol/L）正常对照组　9　7.18±0.90　40.44±4.15 DM模型组　7　14.10±1.19*　70.49±5.47*中药高剂量组　8　8.92±1.07*#△　50.35±5.02*#△中药中剂量组　8　10.44±1.09*#　60.33±5.51*#中药低剂量组　8　12.21±1.12*#　65.24±4.97*#西药对照组　8　8.88±0.93*#　49.63±5.22*#

2.324 h尿微量白蛋白动态变化比较实验期间，第4、8、12周，DM模型组、中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠24 h尿微量白蛋白（ALB）含量逐渐增加（P＜0.01）；中药各剂量组和西药对照组从第4周开始ALB含量较DM模型组降低（P＜0.01）。见表3。

表3　各组大鼠4、8、12周末ALB比较（±s）Tab.3　Comparison of ALB of rats in each group at 4，8，12 weeks（±s）

表3　各组大鼠4、8、12周末ALB比较（±s）Tab.3　Comparison of ALB of rats in each group at 4，8，12 weeks（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.01；与西药组比较，▲P＞0.05，△P＜0.05。

组别　动物数　4周　8周　12周正常对照组　9　9.87±0.56　10.16±0.47　10.64±0.57 DM模型组　7　25.86±1.28*　36.56±2.19*　50.06±2.54*中药高剂量组　8　15.05±0.17*#△23.06±0.99*#△31.38±0.88*#△中药中剂量组　8　17.03±0.57　25.44±0.71*#▲34.65±0.77*#中药低剂量组　8　19.23±0.69*#　28.88±1.00*#　39.36±0.93*#西药对照组　8　15.79±0.42*#　24.48±0.48*#　32.66±0.79*#

2.4病理组织学改变1）光镜观察：正常对照组大鼠肾小球无明显异常，系膜细胞（MC）无增生，肾小球系膜区细胞外基质（ECM）无明显增多，绝大部分毛细血管袢开放，间质无明显炎细胞浸润，无纤维组织增生，肾小球囊无渗出、无粘连，近端小管结构正常；DM模型组大鼠肾小球系膜区弥漫性增宽，肾小球基底膜（GBM）增厚，MC轻度增生，肾小球ECM增多，部分毛细血管受压而塌陷，间质纤维组织增生，肾间质中炎性细胞浸润，肾小球囊粘连；中药各剂量组、西药对照组肾小球结构也有类似病理改变，但较DM模型组明显减轻，大鼠肾小球ECM增多、MC增生较DM模型组明显减轻，大部分毛细血管腔处于开放状态，间质纤维组织增生较DM模型组减少。2）电镜观察：正常对照组大鼠肾小球滤过膜结构完整，毛细血管内皮细胞正常，GBM薄厚均匀，足细胞结构完整，足突排列整齐、清晰、分布均匀，系膜区未见扩大，系膜基质无明显增多；DM模型组大鼠肾小球滤过膜明显改变，GBM弥漫性增厚，内皮细胞广泛融合、增生，足细胞足突广泛融合，足细胞数目减少，系膜区扩大，基质明显增多；中药各剂量组与西药对照组病理改变不同程度减轻，大鼠肾小球毛细血管内皮细胞正常，GBM未见增厚，足突部分融合，系膜区未见明显扩大。

2.5α-actinin-4蛋白表达正常对照组的α-actinin-4蛋白沿着肾小球基底膜毛细血管样点线状分布均匀（图1A）；DM模型组的α-actinin-4蛋白表达明显高于正常对照组（图1B）；中药高、中、低剂量组和西药对照组的α-actinin-4蛋白表达较DM模型组减弱（图1C～F）。DM模型组、中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠α-actinin-4灰度值均高于正常对照组（P＜0.01）；中药高、中、低剂量组和西药对照组大鼠灰度值均低于DM模型组（P＜0.01）。见表4。

2．6α-actinin-4 m RNA的表达DM模型组、中药高、中、低剂量组、西药对照组大鼠的α-actinin-4 mRNA含量均明显高于正常对照组（P＜0.01）；中药高、中、低剂量组和西药对照组α-actinin-4 m RNA含量均低于DM模型组（P＜0.01）。见表5。

3　讨论

近几年来，中国DM患者人数与日俱增，约占全球DM患者人数的三分之一，已经成为DM患病率较高的国家之一，2型DN的发生率约33%-48%［1］。DN是糖尿病的常见而慢性微血管并发症，导致慢性肾功能衰竭的主要原因，亦是DM患者的主要死亡原因。

图1　各组大鼠肾脏α-actinin-4免疫组化（×400）Fig.1　Immunohistochemical staining of α-actinin-4 in kidney of rats in each group（×400）

表4　各组大鼠肾组织α-actinin-4蛋白比较（±s）Tab.4　Comparison of the protein exprossion of α-actinin-4 in kidney of rats in each group（±s）

表4　各组大鼠肾组织α-actinin-4蛋白比较（±s）Tab.4　Comparison of the protein exprossion of α-actinin-4 in kidney of rats in each group（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.01；与西药组比较，△P＜0.05。

组别　动物数　α-actinin-4正常对照组　9　54.57±6.16* DM模型组　7　143.78±4.84中药高剂量组　8　63.25±5.15*#中药中剂量组　8　66.25±5.04*#中药低剂量组　8　102.13±4.52*#△西药对照组　8　96.38±5.48*#

“毒损肾络”是导师南征教授提出的消渴肾病的病机关键之一。毒是指一切对机体的生理功能产生不良影响的致病因素。毒邪分为内毒和外毒，外毒是指外邪直接侵入机体，而致机体受损的一类物质；内毒是指由脏腑功能失常和气血运行失调，使体内的病理产物不能及时排出，积久造成气滞、血瘀、痰凝、湿浊、水停等病理产物，邪盛而成热毒、瘀毒、痰毒、湿毒、浊毒、燥毒等毒邪。毒邪多在疾病过程中产生，又是继续损害机体的因素，会形成恶性循环。因消渴病迁延日久，则散膏损伤，三焦气化受阻，脂膏堆积，痰湿、湿热、瘀滞相结成毒邪，其毒邪伏于膜原，毒损肾络，肾体用皆损，肾间动气大伤，气血逆乱，而成消渴肾病［2］。依秋霞等［3］认为，因消渴日久，脂毒内生，阻于肾络气机运行，阻碍津血运行，凝聚而成膏脂，亦可成痰瘀，致病的膏脂与新产生的膏脂和痰瘀胶着黏滞，再生新的毒邪，而损伤肾络，循环往复，终致消渴肾病。毒损肾络与消渴肾病密切相关，脂毒在病情过程中起关键的作用。“邪伏膜原”是导师南征教授近期提出的理论，是根据消渴肾病的缠绵难愈特点，又深入研究膜原的范围和作用而提出。从后世许多医家对膜原的描述上来认为，膜原是一种膜样组织，包括脏腑间联系膜，肌肉筋骨间膜、胸膜、腹膜等组织以及现代医学中肾小球滤过膜等微观结构，其分布广泛，具有联系机体表层与内深层各个组织，沟通气血，输布津液，起着桥梁与纽带作用。南征［4］认为，治疗消渴肾病的治则为扶正祛邪，攻补兼施。治以解毒通络益肾、调散膏、达膜原。榛花消肾安胶囊是南征教授常用的治疗糖尿病肾病的经验方，在临床上疗效显著。组成为榛花、土茯苓、黄芪、覆盆子、穿山甲、血竭、金荞麦、益母草、草果、槟榔、厚朴，具有解毒通络，益肾导邪疏利膜原之功。α-actinin-4是肌动蛋白交连蛋白，维持细胞结构起重要作用，能交联肌动蛋白微丝，将肌动蛋白交联成可收缩的纤维束［5］。主要表达于足细胞，其基因突变可引起足突融合、消失，致使蛋白尿的产生。高糖和糖基化终末产物（AGEs）均可使α-actinin-4表达的减少，可致DN肾小球足细胞骨架的破坏［6］。Dandapani等［7］研究发现，不够α-actinin-4鼠的肾小球足细胞数量与尿中足细胞的含量均减少。在高糖与晚期糖基化产物联合下，足细胞αactinin-4的表达减少。杨晓等［8］观察研究造模DM大鼠的α-actinin-4表达水平，随着病情进展，αactinin-4水平逐渐减少，可参与DM大鼠蛋白尿的产生，可能与糖基化终末产物（AGEs）的含量增多有关。段玉红等［9］研究发现，糖尿病时持续高血糖，脂代谢紊乱特异性损害Nephrin、α-actinin-4的表达，并造成足细胞损伤，是足细胞数目减少，出现尿蛋白。

表5　各组大鼠肾组织α-actinin-4 mRAN表达水平的比较（±s）Tab.5　Comparison of α-actinin-4 mRAN expression levels in kedney of rats in each group（±s）

表5　各组大鼠肾组织α-actinin-4 mRAN表达水平的比较（±s）Tab.5　Comparison of α-actinin-4 mRAN expression levels in kedney of rats in each group（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.01；与西药组比较，△P＞0.05。

组别　动物数　α-actinin-4 mRNA正常对照组　9　0.28±0.06* DM模型组　7　0.86±0.08中药高剂量组　8　0.40±0.04*#中药中剂量组　8　0.57±0.04*#中药低剂量组　8　0.58±0.06*#△西药对照组　8　0.46±0.07*#

本实验表明，榛花消肾安胶囊能够改善实验性DM大鼠的一般状态，降血糖、血肌酐和尿素氮；改善实验性DM大鼠肾脏组织的病理结构，减轻肾小球基底膜增厚，细胞外基质的积聚，系膜增生，改善足细胞形态，从而减轻DM性肾小球硬化；能够抑制实验性DM大鼠早期肾脏肥大，减少ALB的排出，改善肾功能，而且能够抑制实验性DM大鼠肾组织α-actinin-4蛋白及m RNA的表达。

［1］张真真.中西医结合糖尿病肾病高峰论坛在京召开［N］.中国中医药报海外版，2011-01-08（1）.

［2］南征，朴春丽，何泽，等.消渴肾病诊治新论［J］.环球中医药，2012，5（8）：598-599.

［3］依秋霞，生生，李敬林，等.从脂毒及毒损肾络探讨糖尿病肾病病理机制［J］.辽宁中医药大学学报2014，16（3）：58-59.

［4］南红梅，周凤新，韩香莲，等.南征教授治疗消渴肾病新路径［J］.长春中医药大学学报，2012，28（1）：52-53.

［5］Dessapt C，Hargreaves R，Dei CA，et al.Modulation of alpha 3-beta 1 integrin expression and cell adhesion in glomerular podocytes by glucose and mechanical stretch［J］.Diabetic Med，2004，21（2）:10-11.

［6］Lu C，Ren W，Su XM，et al.CREB and Spl regulate the human CD2AP gene promoter activity in renal tubular epithelial cells.Archives of biochemistry and biophysics，2008，474（1）:143-149.

［7］Dandapani SV，Sugimoto H，Matthews BD，et al.Alpha-actinin-4 is required for normal podocyte adhesion［J］.J Biol Chem，2007，282（1）: 467-477.

［8］杨晓，孙希锋，张春.糖尿病大鼠肾脏α-辅肌动蛋白-4表达变化及作用机制［J］.中国中西医结合杂志，2008，9（3）:195-198.

［9］段玉红，田小燕，王维刚，等.Nephrin，α-actinin-4在糖尿病大鼠肾组织中的表达及其与足细胞数目的相关性研究［J］.广西医科大学学报，2012，29（1）：41-44.

（本文编辑：马英，滕晓东）

Study on the podocyte associated protein α-actinin-4 of experimental diabetic rats treated with Zhenhua Xiaoshen An capsules

ZHAO Cheng-ya1，2，HAN Xiang-lian2，NAN Zheng3
（1.Korea；2.Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130021，China；3.The Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130021，China）

［Objective］Through this experiment to observe the experimental diabetic rats renal and podocyte associated protein α-actinin -4 expression，indicate Zhenhua Xiaoshen An capsules effectiveness of diabetic nephropathy in the treatment of diabetic nephropathy. ［Methods］To establish the model of STZ induced diabetic rats model group，control group，Traditional Chinese medicine group，Western medicine group.Traditional Chinese medicine group was given Zhenhua Xiaoshen An capsule.Western medicine group was given irbesartan.Fasting blood glucose，24 h Urine micro albumin，Scr，BUN were detected with optical microscope，transmission electron microscope and immunohistochemistry in order to observe the expression of podocyte skeletal protein α-actinin-4.The expression of αactinin-4 mRNA were detected with Real-time quantitative PCR.［Results］After the intervention，the urine volume of traditional Chinese Medicine traditional Chinese medicine high，middle，low dose group and Western medicine control group obviously decreased，compared with that of DM model group（P＜0.01）.The blood glucose of rats in Traditional Chinese medicine every dose group and Western medicine control group were obvious lower than that in DM model group（P＜0.01）.The α-actinin-4 mRNA contents of rats in traditional Chinese medicine every dose group and Western medicine control group were lower than that in DM model group（P＜0.01）.［Conclusion］Zhenhua Xiaoshen An capsules can reduce to experimental DM rats blood glucose，serum creatinine，blood urea nitrogen and excrete urine micro albumin，and improve renal function.It also can restrain the incresing of the renal volume of experimental DM rats at early stage and the protein and mRNA expression of α-actinin-4.

Zhenhua Xiaoshen An capsule；diabetic nephropathy；podocyte；α-actinin-4

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.07.15

R587.1

A

1672-1519（2016）07-0440-05

2016-03-28）