银杏叶提取物对电离辐射下大鼠骨髓间充质干细胞的保护作用机制研究

宋媛媛，吕　欣，高春时，王　瑞，张　鹏，任　明，李　波*

(1.吉林大学公共卫生学院 流行病与统计教研室，吉林 长春130021；2.吉林大学第二医院 骨科)



银杏叶提取物对电离辐射下大鼠骨髓间充质干细胞的保护作用机制研究

宋媛媛1，吕欣1，高春时1，王瑞1，张鹏1，任明2*，李波1*

(1.吉林大学公共卫生学院 流行病与统计教研室，吉林 长春130021；2.吉林大学第二医院 骨科)

目的探讨银杏叶提取物(EGB)对辐射引起大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)损伤的保护作用及机制研究。方法利用全骨髓细胞贴壁法分离纯化BMSCs，取第3代细胞为实验研究对象，并将其随机分为5组，分别为正常对照组(Control)、辐射对照组(IR)、辐射加EGB低剂量组(IR+EGBL)、辐射加EGB中剂量组(IR+EGBM)和辐射加EGB高剂量组(IR+EGBH)；分别给予不同的处理因素。采用CCK-8法检测各组细胞存活率，Hoechst荧光染色法检测各组细胞凋亡率，利用荧光定量PCR法定量检测凋亡相关基因Bax和Bcl-2 mRNA表达量，应用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测凋亡蛋白caspase3的活性。结果与正常对照组相比，辐射组和辐射加EGB低、中、高剂量组细胞存活率均显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达量显著下降(P<0.05)，促凋亡基因Bax mRNA表达量显著升高(P<0.05)，Caspase3活性显著升高(P<0.05)；与辐射对照组相比，辐射加EGB低、中、高剂量组细胞存活率均显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，Bcl-2 mRNA表达量显著升高(P<0.05)，Bax mRNA表达量显著降低(P<0.05)，Caspase3活性显著降低(P<0.05)，均以辐射加EGB中剂量组最显著。结论EGB可以拮抗辐射导致的BMSCs细胞存活率降低，通过caspase3通路减少辐射后BMSCs细胞凋亡，进而减轻BMSCs细胞的辐射损伤。

银杏叶提取物；骨髓间充质干细胞；电离辐射；细胞凋亡

(ChinJLabDiagn,2016,20:1235)

随着核能、放射源和射线等在各种行业领域的广泛应用，人们在日常生活中遭受电离辐射(Ionizing Radiation,IR)的机会越来越大[1,2]。辐射对人体损伤较大，主要可造成人体的血液、胃肠消化、神经和皮肤等一个或多个系统损伤，并且与辐射剂量和时间密切相关[3]。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stemcells,BMSCs) 具有自我更新、旁分泌和多向分化等特性，这些特性可以给为人类细胞移植或组织器官修复重建等提供可靠的自体或异体资源[4]。银杏叶成分复杂，银杏叶提取物(Ginkgo biloba L.extract,EGB)具有抗氧化、清除自由基、增强机体免疫功能、抑制血小板凝聚酶、抗突变、抗衰老、抗癌、抗病毒等多方面的生理活性。有研究表明，EGB可降低受辐射小鼠骨髓细胞微核出现率和染色体畸变率[5]。本研究通过不同剂量EGB作用于受电离辐射大鼠，探讨EGB对辐射引起大鼠BMSCs损伤的保护作用及机制研究。

1　材料与方法

1.1实验动物和主要试剂

出生5-7天Wista大鼠购自吉林大学动物实验中心。银杏叶提取物购自德国威玛舒培博士药厂，L-DMEM培养液和胎牛血清(FBS)均购自美国Gibco公司，CCK-8试剂盒、Hoechst染色试剂盒和Caspase-3酶联免疫试剂盒购自上海碧云天生物技术公司，TRIZOL购自美国Thermo Fisher Scientific公司，逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自上海生工生物工程公司。

1.2大鼠BMSCs原代培养

采用全骨髓细胞贴壁法分离纯化BMSCs。处死Wistar大鼠幼鼠，取出股骨，用L-DMEM培养液将骨髓冲出，制成单细胞悬液，以1×106ml-1的细胞密度接种于25 cm2培养瓶中，加入含10% FBS的L-DMEM培养液，置于37℃、 5% CO2培养箱中培养。3天后换半液，7天后细胞融合达80-90%时进行传代。

1.3实验分组

取第3代大鼠BMSCs细胞，将其随机分为5组，分别为正常对照组(Control)、辐射(IR)对照组、辐射加EGB低剂量组(IR+EGBL)、辐射加EGB中剂量组(IR+EGBM)和辐射加EGB高剂量组(IR+EGBH)。Control组不给予处理因素，除Control组外其它四组细胞均给予5.0 Gy的X射线照射，IR+EGBL组加入EGB至终浓度为100 μg/ml，IR+EGBM组加入EGB至终浓度为200 μg/ml，IR+EGBH组加入EGB至终浓度为400 μg/ml。

1.4CCK-8法检测细胞存活率

将BMSCs细胞密度调整为5×104ml-1，每孔100 μl接种于96孔板中，待细胞融合达80-90%时，于照射前1h辐射加EGB低、中、高剂量组分别加入EGB100 μg/ml、200 μg/ml和400 μg/ml，设置3复孔。照射后继续培养24 h，每孔加入10 μl CCK-8，37度培养箱中培养2 h，应用酶标仪在450 nm处测光密度值(OD)。

1.5Hoechst染色

按细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒说明书进行操作，具体步骤如下。

1.5.1吸尽培养液，加入固定液，固定10 min。

1.5.2去固定液，用冷PBS洗2遍，3 min/次。

1.5.3加入Hoechst33258染色液，染色5 min。

1.5.4去染色液，用冷PBS洗2遍，3 min/次。

1.5.5滴加抗荧光猝灭剂封闭

1.5.6采用激发波长350 nm，发射波长460 nm，荧光显微镜下观察并拍照

1.5.7计数1000个BMSCs细胞中发射凋亡细胞的个数，计算细胞凋亡百分率。

1.6荧光定量PCR法检测Bax和Bcl-2 mRNA表达

1.6.1总RNA提取：按照Invitrogen TRIZOL试剂说明书进行操作，提取细胞总RNA。

1.6.2cDNA的合成：按照M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒说明书配置反应液：取总RNA 1 μg，加入1 μl随机引物，用无RNA酶水定容至12 μl，65℃温浴5 min，冰浴30 s，然后在反应液中加入5×Recation Buffer 4 μl、RNase Inhibitor 1 μl、dNTP Mix 2 μl、M-MuLV RT 1 μl，混匀后25℃温浴10 min，42℃温浴60 min，70℃加热10 min。

1.6.3荧光定量PCR：按照2×SG Fast qPCR Master Mix试剂盒说明书配置反应液：取cDNA 0.2 μl，加入2×SG Fast qPCR Master Mix 10 μl、上/下游引物各0.4 μl(10 μM each)、双蒸水定容至20 μl。目的基因Bax、Bcl-2及内参基因GAPDH引物序列见表1。反应程序如下：95℃预变性5 min，95℃变性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，反应重复35个循环。反应产物通过琼脂糖凝胶电泳及绘制熔解曲线检测其扩增效果。反应完毕后数据采用2-ΔΔCt方法处理。

表1　目的基因Bax、Bcl-2及内参基因GAPDH引物序列

引物序列按5’→3’排序，F：上游引物，R：下游引物

1.7ELISA法检测Caspase3活性

按照Caspase3活性测定试剂盒说明书进行检测，具体步骤如下。

1.7.1吸取培养液，胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。

1.7.2600 g 4℃离心5 min，收集细胞，吸除上清，PBS洗涤。

1.7.3加入50 μl裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15 min。

1.7.44℃ 20,000 g离心10 min，收集上清液。

1.7.5加入Ac-DEVD-pNA (2 mM)。

1.7.637℃孵育60-120 min。发现颜色变化比较明显时，测定A405。

1.8统计学方法

2　结果

2.1CCK-8法检测EGB对电离辐射下BMSCs细胞存活率的影响

辐射可显著降低BMSCs细胞存活率，IR+EGB组细胞存活率显著高于IR组，尤其是IR+EGBM组最为明显(P<0.05)，见图1。提示EGB对辐射下的BMSCs细胞有保护作用。

*:与Control组相比，P<0.05；#:与IR组相比，P<0.05；△:与IR+EGBM组相比，P<0.05

图1EGB对电离辐射下BMSCs细胞存活率的影响

2.2Hoechst染色法检测EGB对电离辐射下BMSCs细胞凋亡的影响

如图2所示，BMSCs细胞在正常状态下细胞核呈圆形，辐射后BMSCs细胞核皱缩、染色质浓集，呈强蓝色荧光。图3的结果表明与Control组相比，IR组、IR+EGBL组、IR+EGBM和IR+EGBH组BMSCs细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，EGB能显著降低因辐射所致升高的细胞凋亡率，尤其是IR+EGBM组最为明显(P<0.05)。

图2　各组细胞Hoechst荧光染色图片(×200)

*:与Control组相比，P<0.05；#:与IR组相比，P<0.05；△:与IR+EGBM组相比，P<0.05

图3EGB对电离辐射下BMSCs细胞凋亡的影响

2.3各组细胞Bax和Bcl-2 mRNA表达

如图4所示，扩增产物琼脂糖凝胶电泳呈独立、清晰的条带，长度与设计预期相符合；扩增产物熔解曲线呈单峰，结果表明扩增产物符合设计预期要求。

如图5所示，与Control组相比，IR组、IR+EGBL组、IR+EGBM和IR+EGBH组BMSCs细胞抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达量显著下降(P<0.05)，促凋亡基因Bax mRNA表达量显著升高(P<0.05)；与IR组相比，IR+EGBL组、IR+EGBM和IR+EGBH组BMSCs细胞抗凋亡基因Bcl-2mRNA表达量显著升高(P<0.05)，促凋亡基因Bax mRNA表达量显著降低(P<0.05)，以IR+EGBM组最显著。

图4荧光定量PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳(A)及熔解曲线(B)

*:与Control组相比，P<0.05；#:与IR组相比，P<0.05；△:与IR+EGBM组相比，P<0.05

2.4各组细胞Caspase3活性

辐射可激活BMSCs细胞Caspase3通路，Caspase3活性显著升高，IR+EGB组细胞Caspase3活性显著低于IR组，尤其是IR+EGBM组最为明显(P<0.05)，见图6。

3　讨论

现今，人们不可避免的生活在各种程度的电离辐射下。而电离辐射不仅可对细胞产生损伤[6]，在一次照射一定剂量时对人及动物也产生损伤，低剂量电离辐射对植物和动物也会产生一定的刺激作用[7]。

研究发现，辐射造成的长期骨髓抑制主要依赖残留的造血干细胞和BMSCs进行恢复[8,9]。本实验采用大鼠BMSCs为研究对象，用CCK-8法检测EGB对电离辐射下BMSCs细胞存活率的影响。研究发现辐射组BMSCs细胞存活率明显低于对照组，BMSCs细胞凋亡率显著升高，加入不同剂量EGB可提高电离辐射后的BMSCs细胞存活率，其中IR+EGBM中剂量组效果最好，显著降低因辐射所致升高的BMSCs细胞凋亡率。提示EGB对BMSCs细胞存活具有保护作用。Caspase家族蛋白酶在细胞凋亡过程中发挥重要作用，Caspase3是效应Caspase分子的重要代表，是凋亡的关键蛋白酶，被称为“死亡蛋白酶”，Caspase3被激活后即发生下游的一系列级联反应，使凋亡不可避免[10]。有研究发现，沉默Caspase3 可加快BMSCs的生长速度并提高一定条件下其抗凋亡能力[11]。

*:与Control组相比，P<0.05；#:与IR组相比，P<0.05；△:与IR+EGBM组相比，P<0.05

图6EGB对电离辐射下BMSCs细胞Caspase3通路的影响

本研究显示，电离辐射可激活BMSCs的Caspase3通路，Caspase3活性显著升高，加入EGB后 Caspase3活性显著低于IR组，其中EGB中剂量组效果最明显，提示EGB可以通过作用于Caspase3通路来降低辐射后BMSCs的细胞凋亡率，为EGB的进一步临床应用奠定实验基础。

4　结论

4.1EGB可以拮抗电离辐射造成的BMSCs细胞存活率降低。

4.2EGB通过caspase 3通路减少辐射后BMSCs细胞凋亡，进而减轻BMSCs细胞的辐射损伤。

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The protective effects of Ginkgo biloba extract on ionizing radiation-induced rat bone marrow mesenchymal stem cells injury

SONG Yuan-yuan1,LV Xin1,GAO Chun-shi1,et al.

(1.DepartmentofEpidemiologyandBiostatistics,SchoolofPublicHealth,JilinUniversity,Changchun,Jilin130021,China;2.DepartmentofOrthopedics,SecondHospital,JilinUniversity)

ObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism on radiation-induced rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) damage.MethodsUsing the method of whole bone marrow adherent cells isolated purified BMSCs,3rd passage cells as experimental study,and were randomly divided into five groups,namely normal control group (Control),radiation control group (IR),radiation and EGB low dose group (IR+EGBL),radiation and EGB medium dose group (IR+EGBM) and radiation and EGB high dose group (IR+EGBH),were given different treatment factors respectively.Cell viability was detected Using CCK-8 method,the apoptotic rate was detected by Hoechst Staining,mRNA expression of Bax and Bcl-2 were detected by quantitative real-time PCR and caspase3 activity was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsCompared with normal control group,the cell survival rate of IR,IR+EGBL,IR+EGBM and IR+EGBH group were significantly lower (P<0.05),the apoptosis rate were significantly higher (P<0.05),mRNA expression of antiapoptotic gene Bcl-2 were significantly lower (P<0.05),and mRNA expression of promote apoptosis gene Bax were significantly higher (P<0.05),Caspase3 activity were significantly higher (P<0.05);Compared with the radiation group,the cell survival rate of the IR+EGBL,IR+EGBM and IR+EGBH group were significantly higher (P<0.05),the apoptosis rate were significantly lower (P<0.05),the mRNA expression of Bcl-2 were significantly higher (P<0.05),the mRNA expression of Bax were significantly lower (P<0.05),Caspase3 activity were significantly lower (P<0.05),IR+EGBM group had the most significant change.ConclusionEGB can antagonize the cell viability lowing of BMSCs reduced by radiation,through inhibiting caspase 3 path reducing to BMSCs apoptosis after radiation,thereby reducing radiation damage of BMSCs cells.

Ginkgo biloba extract;Bone marrow mesenchymal stem cells;Ionizing radiation;Apoptosis

国家自然科学基金资助项目(81503531)；吉林省教育厅"十二五"科学技术研究项目(吉教科合字[2015]第536号)；吉林省卫生计生委科技计划项目〔2015Q024〕；吉林大学白求恩计划项目(2015404)

1007-4287(2016)08-1235-05

R285.5

A

2016-05-15)