英夫利昔单抗对小鼠骨髓树突状细胞的免疫调节作用及其机制探讨

何　懿，韩姣婵，孙尔维

(南方医科大学第三附属医院 风湿免疫科，广州 广东510630)



英夫利昔单抗对小鼠骨髓树突状细胞的免疫调节作用及其机制探讨

何懿，韩姣婵，孙尔维*

(南方医科大学第三附属医院 风湿免疫科，广州 广东510630)

目的探讨英夫利昔单抗(Infliximab)对小鼠骨髓树突状细胞(BMDCs)的免疫调节作用及机制。方法分离6-8周健康C57BL/6小鼠骨髓，刺激诱导产生未成熟DCs,分别采用0、10 μg/ml、50 μg/ml、250 μg/ml的Infliximab处理BMDCs，检测其凋亡坏死情况。进一步用脂多糖(LPS)刺激，检测协同共刺激分子CD40、CD80、CD86和抗原递呈分子MHCⅡ类抗原表达情况；Infliximab预处理BMDCs，再用LPS刺激，用迁移小室进行培养，用CCL21对BMDCs进行趋化，检测BMDCs迁移能力的变化。结果250 μg/ml的Infliximab作用后BMDCs的凋亡坏死明显增加，因此实验剂量选用50 μg/ml；Infliximab处理的BMDCs在LPS刺激后，CD40、CD80、CD86及MHCⅡ类抗原表达下调；Infliximab处理的BMDCs在LPS刺激后对CCL21的趋化反应性下降(P均<0.05)。结论英夫利昔单抗(Infliximab)通过影响小鼠骨髓树突状细胞(BMDCs)的成熟、迁移来抑制BMDCs对适应性免疫反应的启动作用，进而影响自身免疫性疾病的发生发展。

英夫利昔单抗；树突状细胞；成熟；迁移

(ChinJLabDiagn,2016,20:1246)

抗原呈递细胞(APC)主要功能是对抗原物质的摄取、加工，并将抗原肽呈递给特异性T淋巴细胞，是启动免疫应答的关键因素，是连接固有免疫和适应性免疫之间的桥梁[1,2]。树突状细胞(DCs)是目前已知功能最强的APC，在适应性免疫的启动中至关重要[3]，在类风湿性关节炎[4]、系统性红斑狼疮[5]、强直性脊柱炎[6]及炎症性肠病[7]等自身免疫性疾病的发病中起到重要作用。

肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一个炎症细胞因子，主要由活化的巨噬细胞和淋巴细胞产生，在炎症反应中发挥重要作用[8]。一些抗TNF-α制剂(如化合物，单克隆抗体等)陆续被开发出来用于治疗TNF-α相关疾病，如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎及克罗恩病等自身免疫性疾病。英夫利昔单抗(Infliximab)是肿瘤坏死因子单克隆抗体(人鼠嵌合型)，广泛应用于类风湿关节炎以及强直性脊柱炎等自身免疫疾病的治疗中。但是它对树突状细胞的影响尚未报道。

本研究通过探讨英夫利昔单抗(Infliximab)对小鼠骨髓树突状细胞(BMDCs)成熟、迁移的影响来进一步明确其免疫调节的机制，为其临床应用提供更充分的理论依据。

1　材料和方法

1.1实验动物

6-8周龄SPF级纯系雄性C57BL/6小鼠购自南方医科大学实验动物中心。

1.2药物与试剂

英夫利昔单抗(Infliximab)购自西安杨森制药有限公司，脂多糖(LPS)购自Sigma-Aldrich (St.Louis,MO)，重组鼠(rm)-GM-CSF and rm-CCL21 购自PeproTech，CD11c磁珠及柱子，FITC-AnnexinV 凋亡检测试剂盒，抗小鼠FITC-CD11c、APC-CD40、PE-CD80、APC-CD86、PE-MHC II 流式抗体及相应同型抗体均购自R&D systems，澳洲胎牛血清、RPMI 1640培养基和PBS购自Gibco，24孔板迁移小室(8.0μm pore size)购自Corning(Acton,MA)。

1.3小鼠BMDCs的分离和培养

小鼠BMDCs的分离和培养参考文献[9]进行。制备骨髓细胞，第6天，收集半贴壁和悬浮的细胞，为不成熟BMDCs，迁移试验中需要用CD11c磁珠纯化细胞，流式检测纯化率>95%。

1.4英夫利昔单抗(Infliximab)对小鼠BMDCs的细胞毒性分析

将BMDCs用英夫利昔单抗(Infliximab)(超纯水溶解)刺激24 h，收集细胞并按照说明书对细胞进行FITC-AnnexinV/ propidium iodine染色，流式细胞术检测BMDCs凋亡坏死率。

1.5英夫利昔单抗(Infliximab)对小鼠BMDCs表面共刺激分子表达的影响

在BMDCs培养的第6天，分别加入LPS(1 μg/ml),Infliximab(50 μg/ml) ,LPS +Infliximab 50 μg/ml培养24 h,收集细胞，PBS洗两遍，每管分别加入上述抗小鼠CD11c，抗CD40、抗CD80、抗CD86、抗MHC II及小鼠IgG同型对照抗体各1 μl，阴性对照管不加任何抗体，流式细胞仪检测。

1.6英夫利昔单抗(Infliximab)对小鼠BMDCs趋化能力的影响

在BMDCs培养的第6天，离心收集细胞，用CD11c磁珠对其进行纯化。纯化后的BMDCs用LPS(1μg/ml),Infliximab(50 μg/ml) ,LPS +Infliximab 50 μg/ml作用24 h，分析上述处理过的细胞对趋化因子CCL21的反应能力。CCL21置于24孔板迁移小室的下室，溶于500 μl不含血清的培养基中，使其浓度为200 ng/ml，上述处理过的BMDCs用无血清的培基重悬，置于24孔板迁移小室的上室，为100 μl培基中含2×105个细胞，在 37℃,5% CO2孵箱中孵育3 h，流式细胞术检测迁移到下室的BMDCs的数目。

1.7统计分析

采用SPSS19.0软件进行统计分析，所有数据采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析(One way-ANOVA)。

2　结果

2.1高浓度英夫利昔单抗(Infliximab)使小鼠BMDCs凋亡坏死率增加

随着英夫利昔单抗(Infliximab)药物浓度的增加，小鼠BMDCs凋亡坏死率增加，在浓度达到250 μg/ml时，BMDCs的凋亡坏死率明显增加(P<0.05)，但是在50 μg/ml或更低浓度时BMDCs的凋亡坏死率差异不大(见图1)。

图1不同浓度(10 μg/ml、50 μg/ml及250 μg/ml)英夫利昔单抗对BMDCs凋亡坏死率的影响 (*P<0.05).

2.2英夫利昔单抗(Infliximab)抑制小鼠BMDCs表面共刺激分子和抗原递呈分子的表达

如图2(A和B)所示，英夫利昔单抗(Infliximab)明显抑制共刺激分子CD40,CD80,CD86和抗原递呈分子MHCII的表达(P<0.05)。说明英夫利昔单抗(Infliximab)可以抑制BMDCs的成熟。

2.3英夫利昔单抗(Infliximab)抑制小鼠BMDCs的迁移

使用迁移小室对BMDCs的迁移能力进行研究，如(图3)所示，LPS刺激后，BMDCs对CCL21的反应能力明显增强，迁移到下室的细胞数目明显增多。但是，用英夫利昔单抗(Infliximab)处理过的BMDCs对CCL21的反应性明显降低(P<0.05)。说明英夫利昔单抗(Infliximab)可以影响BMDCs的迁移来抑制适应性免疫反应的启动。

ctr：对照组,Inf：英夫利昔单抗组； *:LPS组与LPS加英夫利昔单抗组比较，#：LPS组与对照组比较，*P<0.05，#P<0.05，**P<0.01，##P<0.01)

图2英夫利昔单抗对LPS诱导的BMDCs成熟的影响

ctr：对照组,Inf：英夫利昔单抗组；*:LPS组与LPS加英夫利昔单抗组比较，#：LPS组与对照组比较，**P<0.01，###P<0.001)

图3英夫利昔单抗对BMDCs趋化的影响

3　讨论

DCs是目前已知体内最重要的抗原递呈细胞，而且也是惟一能激活初始型T细胞的抗原递呈细胞，在适应性免疫应答的诱导中具有重要地位[3]。未成熟DCs位于组织和周围淋巴器官，监视和识别外源性和内源性抗原，并通过吞噬、微吞饮和胞吞作用摄取抗原。摄取抗原后，未成熟DCs经历成熟过程，同时向周围淋巴器官迁移。迁移到局部淋巴结后，DCs将携带的抗原物质递呈给T淋巴细胞进而使其活化[11]。本研究发现，英夫利昔单抗(Infliximab)能够可以抑制DCs的成熟和迁移。

众所周知，T细胞的活化需两个信号：第一信号由TCR识别APC表面的抗原肽-MHC复合物所启动；第二信号由T细胞和APC间共刺激分子的相互作用所启动。两个信号才可能有效地诱导T细胞活化，而缺乏共刺激信号可致T细胞应答下降，某些情况下可诱导耐受或T细胞失能[12]。骨髓来源的前体细胞在GM-CSF作用下培养6天分化成未成熟DCs，在LPS作用下诱导为成熟DCs,表现为抗原递呈分子MHCⅡ和共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达上调，黏附分子和趋化因子CXCR4等表达上调。本研究结果发现，BMDCs经LPS刺激后共刺激分子(CD40、CD80、CD86)和抗原递呈分子MHCⅡ高表达，产生成熟DCs。但如果在第6天加入英夫利昔单抗(Infliximab)共培养，则DCs的成熟将受到抑制，表现为共刺激分子及MHCⅡ类分子表达下调。

APC是连接固有免疫和适应性免疫之间的桥梁，APC只有识别、摄取并加工处理了抗原后分化成熟，趋化因子受体CXCR4等表达上调[10]，在相应趋化因子的诱导下迁移至局部淋巴结，将抗原递呈给T淋巴细胞后才能激活适应性免疫，因此，APC的迁移在适应性免疫反应的启动中至关重要。阻断APC的迁移，则可以阻断APC与局部淋巴结的T淋巴细胞相互作用，是局部淋巴结T淋巴细胞处于原始状态，避免适应性免疫应答的启动[11]。本研究发现，BMDCs经LPS刺激后对趋化因子CCL21的趋化反应性增强，但英夫利昔单抗(Infliximab)预处理过的BMDCs的趋化反应性减弱，迁移能力降低。

英夫利昔单抗(Infliximab)是一种TNF-a单克隆抗体，用于治疗自身免疫性疾病，最初关于其机制的研究主要是以TNF-a为靶点，通过中和作用消除体内大量TNF-a的炎症作用，随着进一步打研究，发现，英夫利昔单抗(Infliximab)可以作用于T淋巴细胞，上调Treg的比例[13]，作用于B淋巴细胞，抑制其产生自身抗体[14]，但关于对树突状细胞(DCs)等抗原递呈细胞(APC)的研究尚未有报道，而抗原提呈细胞在自身免疫性疾病的发生中至关重要，因此，本研究以树突状细胞(DCs)为靶点，研究英夫利昔单抗(Infliximab)的免疫调节作用，结果发现，英夫利昔单抗(Infliximab)可以抑制BMDCs的成熟和迁移，从而抑制适应性免疫反应的启动，抑制自身免疫性疾病的发生发展，为其临床应用提供更充分的理论依据。

[1]MeradM,SatheP,HelftJ,etal.TheDendriticCellLineage:OntogenyandFunctionofDendriticCellsandTheirSubsetsintheSteadyStateandtheInflamedSetting[J].AnnuRevImmunol,2013,31:563.

[2]RandolphGJ,OchandoJ,Partida-SánchezS.MigrationofDendriticCellSubsetsandtheirPrecursors[J].AnnuRevImmunol,2008,26:293.

[3]HammerGE,MaA.MolecularControlofSteady-StateDendriticCellMaturationandImmuneHomeostasis[J].AnnuRevImmunol,2013,31:743.

[4]HarryRA,AndersonAE,IsaacsJD,etal.Generationandcharacterisationoftherapeutictolerogenicdendriticcellsforrheumatoidarthritis[J].AnnRheumDis，2010，69(11):2042.

[5]GerlV,LischkaA,PanneD,etal.Blooddendriticcellsinsystemiclupuserythematosusexhibitalteredactivationstateandchemokinereceptorfunction[J].AnnRheumDis，2010，69(7):1370.

[6]ChiocchiaG,CostantinoF,BrebanM.CostantinoandM.Breban,WhatcanimmunophenotypingofTanddendriticcellsteachusaboutthepathophysiologyofankylosingspondylitis[J].Rheumatology(Oxford)，2016，55(1):4.

[7]SalimSY,SilvaMA,KeitaAV,etal.CD83+CCR7-DendriticCellsAccumulateintheSubepithelialDomeandInternalizeTranslocatedEscherichiacoliHB101inthePeyer'sPatchesofIlealCrohn'sDisease[J].AmJPathol，2009，174(1):82.

[8]TamLS,KitasGD,González-GayMA.Gonzalez-Gay,Cansuppressionofinflammationbyanti-TNFpreventprogressionofsubclinicalatherosclerosisininflammatoryarthritis[J].Rheumatology(Oxford)，2014，53(6):1108.

[9]InabaK,InabaM,RomaniN,etal.GenerationofLargeNumbersofDendriticCellsfromMouseBoneMarrowCulturesSupplementedwithGranulocyte/MacrophageColony-stimulatingFactor[J].JExpMed,1992,176(6):1693.

[10]LiuQ,ChenT,ChenG,etal.TriptolideimpairsdendriticcellmigrationbyinhibitingCCR7andCOX-2expressionthroughPI3-K/AktandNF-κBpathways[J].MolImmunol,2007,44(10):2686.

[11]AlvarezD,VollmannEH,vonAndrianUH.MechanismsandConsequencesofDendriticCellMigration[J].Immunity,2008,29(3):325.

[12]HeuzéML,VargasP,ChabaudM,etal.Migrationofdendriticcells:physicalprinciples,molecularmechanisms,andfunctionalimplications[J].ImmunolRev,2013,256(1):240.

[13]ParkW,YooDH,MirandaP,etal.EfficacyandsafetyofswitchingfromreferenceinfliximabtoCT-P13comparedwithmaintenanceofCT-P13inankylosingspondylitis:102-weekdatafromthePLANETASextensionstudy[J].AnnRheumDis.2016Apr26.pii:annrheumdis-2015-208783.doi:10.1136/annrheumdis-2015-208783.[Epubaheadofprint]

[14]NandaKS,CheifetzAS,MossAC.ImpactofAntibodiestoInfliximabonClinicalOutcomesandSerumInfliximabLevelsinPatientsWithInflammatoryBowelDisease(IBD):AMeta-Analysis[J].AmJGastroenterol,2013,108(1):40.

Immunomodulatory effects of Infliximab on maturation and migration of bone marrow derived dendritic cells

HE Yi，HAN Jiao-chan，SUN Er-wei.

(DepartmentofRheumatology,TheThirdAffiliatedHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510630,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Infliximab on maturation and migration of murine bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) and its potential mechanism.MethodsBMDCs were generated in vitro from bone marrow of C57BL/6 mice by being cultured with GM-CSF.For cytotoxicity assay,BMDCs were treated with different concentrations of Infliximab(0,10 μg/ml,50 μg/ml and 250 μg/ml) for 24 h，the rate of apoptosis and necrosis was detected by flow cytometry.For maturation and migration analysis,BMDCs were treated with LPS (1 μg/ml) in the presence of Infliximab.And the expression of CD40、CD80、CD86 and MHCII on BMDCs and the ability of migaration were analyzed by using Flowcytometry.ResultsInfliximab induced significant BMDC apoptosis and necrosis only at concentrations of 250ug/ml or more(P<0.05),but not at the concentrations of 50 μM or less.Infliximab markedly suppressed the expression of costimulatory molecules,such as CD40,CD80,CD86,and MHC class II on the surfaces of the LPS-stimulated DCs.(P<0.05).And aslo Infliximab inhibited the migration of LPS-treated BMDCs in vitro ConclusionInfliximab could suppress the maturation and migration of mouse BMDCs in vitro culture.

Infliximab;dendritic cells;mature; migration

国家自然基金面上项目(81471613)；国家自然基金青年项目(81501417)

1007-4287(2016)08-1246-04

R392.11

A

2016-06-10)