BMSc细胞的粘附及增殖与钛丝直径关系的研究

李宝权，李晓光，钟莉莉

(1.齐齐哈尔医学院第二附属医院 骨二科，黑龙江 齐齐哈尔161000； 2.吉林大学第二医院 研究中心)



BMSc细胞的粘附及增殖与钛丝直径关系的研究

李宝权1*，李晓光1，钟莉莉2

(1.齐齐哈尔医学院第二附属医院 骨二科，黑龙江 齐齐哈尔161000； 2.吉林大学第二医院 研究中心)

目的比较两种不同直径的钛金属纤维丝(50、90 μm)在体外与细胞的粘附能力。并确定哪种钛金属纤维丝与细胞粘附能力较好。方法抽取兔骨髓，用密度梯度离心法分离兔骨髓间充质干细胞(BMSc)，在培养皿中培养并传代，传至3代后，分别接种在两种不同直径的钛纤维丝上，然后通过扫描电镜观察钛纤维丝表面细胞粘附情况，对照组为单纯细胞组。Cell Counting Kit-8检测，即在酶联免疫检测仪上选择450 nm波长测定各孔光吸收值并记录结果。吖啶橙荧光法在荧光显微镜下观察两种不同直径钛纤维丝上的细胞粘附情况，并评价两种不同直径钛纤维丝的粘附指标。结果扫描电镜观察结果：90 μm直径钛纤维丝上的细胞粘附数量与50 μm直径的钛纤维丝上粘附细胞形态良好，片状生长彼此连接紧密，与钛纤维丝粘附紧密。cck-8所检测的结果：50 μm直径钛纤维丝组在开始阶段细胞粘附率要高于90 μm直径钛纤维丝组，但随着时间的进程90 μm直径钛纤维丝组细胞粘附率要更好，有统计学意义(P<0.05)。吖啶橙染色结果：荧光照相结果显示48小时后粘附在90 μm直径钛纤维丝上的细胞数量要高于粘附在50 μm直径钛纤维丝上的细胞数量。结论90 μm直径的钛纤维丝的粘附性要优于50 μm直径的钛纤维丝，对细胞的增殖无明显影响。

钛纤维；BMSc细胞；细胞粘附

(ChinJLabDiagn,2016,20:1270)

现今，随着组织工程及细胞技术的发展，细胞粘附于各种支架材料的研究，已经取得了可观的成果。虽然可供选择生物材料众多，但仍以钛金属为最佳材料。钛金属现已被公认为组织相容性最好的生物材料。各种形态的钛金属被应用于内固定及外固定，同时也广泛用于骨缺损及骨组织工程领域。钛金属材料由于其良好的力学性能和可加工性，在替代与修补人体硬组织方面占有重要地位，其中钛及钛合金又因极佳的生物相容性和良好的耐腐蚀性受到特别重视，已被广泛应用于骨外科。尤其骨缺损是临床上经常遇到的问题，目前常用的方法是植骨术。大多都是以自体骨植入为主。颗粒骨是目前临床较常用的植骨方法。为增加植骨强度可将不同生物材料植入其中。本实验就是应用钛纤维丝为生物内支架材料，利用体外细胞培养扩增技术将种子细胞扩增并和钛纤维丝复合培养，探讨细胞与钛纤维丝之间的增殖及粘附情况，从而得出相应的数据及结论，为钛纤维丝进一步应该于体内进行骨缺损实验提供相关数据。

1　材料与方法

1.1实验动物及材料

2个月龄新西兰大白兔2只，雌雄不限，体量2.5-3.0 kg。 钛纤维丝 直径50 μm、90 μm长度为5 mm，每组200根。

1.2药品与试剂

DMEM F-12培养基、Procoll分离液(Pharmacia)、标准胎牛血清(Hyclone)、青链霉素混合液(Solarbio)、胰蛋白酶(Solarbio)、Cell Counting Kit(CCK-8试剂盒 )、PBS缓冲液(Solarbio)、吖啶橙(Sigma)、戊二醛溶液。

1.3主要仪器

动物实验手术器械；扫描电镜(S-N3400型)；高速离心机；全自动酶标仪(WD-9417B型)；荧光显微镜。

1.4方法

1.4.1兔骨髓间充质干细胞的获得3%戊巴比妥钠静脉麻醉大白兔，穿刺髂骨骨髓血(含肝素)，与Hanks液1∶1混匀，800 r/min离心5 min去脂。用DMEM冲洗，反复几次，将此冲洗液缓慢加入含有percoll(密度1.073)的10 ml离心管中，1 500 r/min离心15 min，取界面细胞，用DMEM反复洗涤细胞2次，离心收集细胞。用含10%胎牛血清的DMEM吹打细胞成单个细胞悬液并接种于50 ml培养瓶，37℃、5%CO2、饱和湿度培养。72 h后，更换新鲜培养液，未贴壁细胞经反复换液去除，待集落形成，细胞生长至80%融合后传代。传代培养时加入0.25%胰酶消化，相差显微镜下观察长梭形BMSc变圆，倾去消化液，加入培养基，并吹打分散细胞。细胞计数板计数，以1×104Pml密度接种于50 ml的培养瓶中。当细胞生长密度达到90%以上时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例传代培养，培养至第三代经流式细胞仪鉴定，备用。

1.4.2BMSc与两种不同直径的钛纤维丝共培养及粘附检测 将传至三代的BMSc消化成细胞悬液待用。钛纤维丝高温消毒后，以每组200根数量平铺于6孔板内。再以每孔1×104个细胞(1ml)分别接种于两种不同直径的(50 μm和90 μm)钛纤维丝中。细胞孵箱中孵育48 h后，以25%戊二醛固定，4℃冰箱过夜行电镜扫描观察。将三代BMSc消化成细胞悬液待用。将钛纤维丝以每组200根数量平铺于24孔板中，分三组，对照组(细胞组)，实验组(50 μm和90 μm组)。将细胞以10×4个细胞(1 ml)分别接种于24孔板中。分别在6、12、24、36、48 h，不同时间点以胰酶消化钛纤维丝上的细胞并收集，分别测得6、12、24、36、48 h酶标仪在紫外吸收光度450 nm测量细胞生长及粘附情况。将三代BMSc以1×104个细胞(1 ml)在96板中与实验组钛纤维丝培养48 h后，分组消化细胞，加入吖啶橙荧光染料，加入染料1 min后，在荧光显微镜下观察细胞形态及数量。

1.5统计学处理

应用SPSS软件包处理，结果以均数±标准差表示，P值<0.05为有显著差异。

2　结果

2.1扫描电镜结果

BMSc在两种直径的钛纤维丝上培养48 h后，做扫描电镜观察(图1)。发现50 μm、90 μm直径的钛纤维丝组上的细胞成片生长，细胞彼此连接，90 μm粘附性更好。

A:电镜下50 μm 直径的钛纤维丝组上的细胞 B:电镜下90 μm 直径的钛纤维丝组上的细胞

图1BMSc在两种直径的钛纤维丝做扫描电镜

2.2CCK-8检测结果

对照组(以下简称细胞组)与实验组(50 μm钛纤维丝组与90 μm钛纤维丝组)所测OD值450，三组细胞增殖速度差异并不明显，50 μm直径钛纤维丝组在开始阶段细胞粘附率要高于90 μm直径钛纤维丝组，但随着时间的进程90 μm直径钛纤维丝组细胞粘附率要更好(表1)。粘附率公式:[OD450(粘附细胞)/OD450(总细胞)×100%] /钛纤维丝表面积50 μm直径钛纤维丝组与90 μm直径钛纤维丝组比较P<0.05

表1　CCK-8测定BMSc在两种不同直径钛纤维丝表面细胞粘附率

2.3吖啶橙荧光染色结果

吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。荧光显微镜下观察细胞均呈均匀一致的圆状结构，发出明亮的绿色荧光，表明细胞未凋亡，属正常存活细胞。实验组两组不同直径的钛纤维丝上消化下来的细胞肉眼可见有明显的数量差异。48 h后90 μm直径钛纤维丝粘附的细胞数量显著多于50 μm直径钛纤维丝上的细胞数量 (图2)。

A:吖啶橙荧光染色下50 μm 直径的钛纤维丝组上的细胞 B:吖啶橙荧光染色电镜下90 μm 直径的钛纤维丝组上的细胞

图2BMSc在两种直径的钛纤维丝做吖啶橙荧光染色

3　讨论

3.1钛金属作为理想的支架材料，其形态的变化对细胞粘附影响较大

不同形态的钛金属因其表面形态各异，因此对细胞的粘附有着一定的影响。邓天燕[1]等人用不同表面形态的钛金属片在体外对小鼠成骨干细胞的粘附做了相关研究。研究表明钛金属表面形态的变化对细胞的粘附有着显著的影响。近年来有很多学者开始对钛纤维复合材料产生了浓厚的兴趣，并且进行了深入的研究。研究发现[2]碳纤维是“惰性、无毒性”生物材料，但是碳纤维因其降解性能较差的特性，并非是理想的组织工程支架材料。又有研究表明[3]，用适量的金属纤维丝增强生物复合材料的机械性能，对人体受力较大的部位的骨缺损的填补移植获得了令人满意的成效。而钛纤维作为骨内植入体和硬组织材料在临床及基础研究上受到了广泛关注。L.D Timmie Topoleski[4，5]等人发现，以钛纤维丝增强的生物材料的力学性能可以提高10%以上。钛及钛合金具有较低的密度、较好的生物相容性，在临床应用广泛。实验证明[6]钛金属纤维丝易于骨细胞的着床、增殖。当钛纤维丝的直径在100 μm以下时，显示出更好的亲和性。本实验虽并未表明钛金属纤维丝易于骨细胞的增殖，但对其增殖并无明显影响，确实易于细胞的着床，因此可以证明钛金属纤维丝确实具有较好的生物相容性，这一形态有助于组织细胞的粘附。

3.2实验材料选择的依据

在骨组织工程中种子细胞的选择对实验研究起到了至关重要的作用。经过多年的研究目前骨髓间充质干细胞(BMSc)是现今骨组织工程中最理想的种子细胞，因为BMSc是一种具有向着多种细胞分化潜能的干细胞[7]。在人体受到外界不同因素刺激时，BMSc在体内不同因子的作用下，通过不断的增殖和分裂能分化成机体所需要的不同细胞来修复受损组织[8]。而在特定的细胞作用及环境下可分化为骨、成骨、软骨、神经元、肌肉、脂肪等细胞，而且易于分离和纯化，自体移植等。所以被广泛认为是骨组织工程的种子细胞的主要来源之一[9]。骨缺损修复是骨组织工程中难题之一，而做为种子细胞的BMSc在骨诱导剂的催化下能够向成骨细胞分化并具有良好的分泌骨基质的能力[10]。因此，本实验选择BMSc做为基础种子细胞。钛金属具有组织相容性好，细胞毒性小，低弹性模量等优点。现已应用于骨组织工程中的多个领域，在临床上应用也极其广泛，比如口腔外科、颌面外科、整形外科等医学领域，其主要作用是修复骨缺损，支撑骨的塑形等。因损伤部位及程度不同，钛金属以不同的形态特征被塑造成各种类型的器械及支架材料。钛纤维做为新型支架材料修复组织缺损[11,12]取得了一定的实验成果。尤其是在体外对细胞的粘附及增殖的影响情况方面的报道近年来已然成为热点[13]，因此能够早日将钛纤维植入体内应用于临床是所有志力于此项研究的工作者的共同愿望。基于以上原因我们选择钛纤维作为实验的主要材料。本实验的目的就是检测钛纤维丝在体外与细胞的粘附及增殖情况，为了进一步体内实验提供前期数据。

3.3实验结果分析

扫描电镜是一种对表面微观世界能够进行全面分析的多功能的一种电子光学仪器。近年来被广泛应用于材料学，冶金学，生物医学等多学科。它可以直接观察样品表面的微观形态，可以在三度空间里进行各个区域的观察，并且可以放大数倍。在接种48小时后，50 μm直径钛纤维丝组可见细胞在钛纤维丝表面生长，形态正常，伸展，粘贴紧密。可见细胞与细胞之间的连接。但是在90 μm直径钛纤维丝组可明显观察到细胞伸展较大，与钛纤维丝表面连接紧密，成片生长，细胞与细胞之间连接较50 μm直径钛纤维丝组更加紧密。总体来说，50 μm直径钛纤维丝组与90 μm直径钛纤维丝组的细胞生长状态在扫描电镜下观察后者要优于前者，不过细胞生长状态均属正常。这项指标结果显示了90 μm直径钛纤维丝组对细胞的粘附度更好。Cell Counting Kit(简称CCK-8)：是用酶联免疫检测仪在450 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、细胞增殖及粘附试验、细胞毒性试验等。CCK-8结果显示，对照组细胞生长趋势改变不是特别明显，因为对照组起始细胞种植量为1×104(1 ml)，种入24孔板中经过48 h的培养基本已经长满细胞，所以在6、12、24、36、48 h这五个时间段的生长趋势并不明显。对照组主要是为了证明实验组(50 μm与90 μm组)与对照组的细胞起始种植量是相等的。主要是测得实验组两组之间细胞的增殖及粘附情况。结果表明，实验组两组细胞生长及增殖在不同时间点上无明显统计学差异。但是随着时间的增长粘附细胞的数量因为两组不同直径的钛纤维丝表面积不同，细胞的粘附率呈现出不同的变化，50 μm直径钛纤维丝组在开始6小时细胞粘附率略高于90 μm直径钛纤维丝组，其余时间段90 μm直径钛纤维丝组的细胞粘附率要高于50 μm直径钛纤维丝组，有明显统计学意义(P<0.05)。因此当钛纤维丝的直径在100 μm以下时，钛纤维丝表面积的大小可能决定细胞粘附率的多少。在不同时间点所消化下来的50 μm直径钛纤维丝组与90 μm直径钛纤维丝组细胞经过吖啶橙荧光染色，在荧光显微镜下可明显观察到细胞的粘附增殖，随着时间的延长细胞粘附的数量呈明显增加趋势。但是因为起始细胞种植量比较大在细胞与钛纤维丝接种后的48小时这间细胞粘附的趋势不是很明显，因为细胞已经生长到达了极限。但仍能发现90 μm直径钛纤维丝组的细胞粘附优于50 μm组，总体来看，90 μm直径的钛纤维丝的粘附性要优于50 μm直径的钛纤维丝，对细胞的增殖虽为起到推动作用，但却无明显的负面影响，因此，可以选择90 μm直径的钛纤维丝作为体内进行骨缺损实验研究的主要材料。

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Different diameter titanium filaments in vitro cell adhesion and proliferation

LI Bao-quan,LI Xiao-guang,ZHONG Li-li.

(DepartmentofOrthopedicsSurgery,QiqiharMedicalCollegeSecondAffiliatedHospital，Qiqihar161000,China)

ObjectiveTo compare two titanium metal fiber filaments of different diameters (50,90 μm) in vitro cell adhesion ability.And to better determine what kind of titanium filaments and cell adhesion capacity.MethodsExtracted rabbit bone marrow,isolated by lymphocyte separation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) cultured and passaged in a petri dish,and spread to three generations,were inoculated with two different diameter titanium filaments,then by scanning electron microscopy titanium fiber filament surface cell adhesion.Cell Counting Kit-8 (CCK-8 kit),i.e.to select a wavelength of 450 nm on the enzyme-linked immunosorbent detector measured the light absorption values of the respective hole,a recording result.Acridine orange fluorescence observed under a fluorescence microscope on the cell adhesion in the two different diameters of titanium fiber filaments and to evaluate the adhesion of the two different diameters titanium filaments indicators.ResultsThe results of scanning electron microscopy results 90 μm diameter titanium fiber wire on the number of cell adhesion is significantly more than the number of cell adhesion 50 μm diameter titanium filaments.90 μm diameter titanium fiber yarn group in the result of the detection by the CCK-8 adhesion was significantly higher than the group of 50 μm diameter titanium fiber filaments.The statistical analysis meaningful (P<0.05).Acridine orange staining showed adhesion 90 μm diameter titanium fiber filaments on the number of cells was significantly higher than the number of cells adhered 50 μm diameter titanium fiber filaments.Conclusion90 μm diameter titanium filaments adhesion superior to 50 μm diameter titanium fiber filaments.

Titanium fiber;Mesenchymal Stem Cells in the bone marrow;Cell Adhesion

齐齐哈尔市科研项目(SFZ0-2013150)

1007-4287(2016)08-1270-04

Q813

A

2015-12-24)