中药成分大腹园蛛粉的细胞及遗传生殖毒性研究

张逸鹤，韩　旭，张　欢，万　鑫，刘宇维，高元奇，费　瑞

(吉林大学基础医学院 细胞生物学系，吉林 长春130021)



中药成分大腹园蛛粉的细胞及遗传生殖毒性研究

张逸鹤，韩旭，张欢，万鑫，刘宇维，高元奇，费瑞*

(吉林大学基础医学院 细胞生物学系，吉林 长春130021)

大腹园蛛(Araneusventricosus)属节肢动物门(Arthropoda)、蛛形纲(Arachnida)、蜘蛛目(Araneae)、园蛛科(Araneidae)、园蛛属(Araneus)，是最常见的蜘蛛之一。目前，大腹园蛛在医疗、保健、食品上都有广泛应用。在饮食保健方面，国外有园蛛酱、园蛛口服液，而中国有园蛛羮[1]。在医学方面，大腹园蛛同样具有很高的药用价殖。据相关资料记载，园蛛成体焙干后可用于治疗背疮、痔疮、阳痿、中风偏瘫、小儿惊风、肾阳亏虚、口噤，疔肿、毒虫咬伤等[2-5]。近年来，随着分子生物学的发展，蜘蛛毒素的研究正在飞速发展，但有关蜘蛛的成体研究在国内外并不常见，其中有关园蛛的成体毒性研究更未见报道。本文的研究结果可为大腹园蛛的进一步开发奠定理论和实验基础。

1　材料与方法

1.1药品与试剂

滤去残渣道大腹园蛛采自吉林省吉林市冯家屯,使用时烘箱焙干并制成干粉，滤去残渣；环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)购于吉林大药房；标准胎牛血清购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司；胰酶购自Hyclone，其他所用试剂均为分析纯。

1.2实验动物

昆明种纯系小鼠，体重18-22 g，雌雄各半。由吉林大学基础医学院实验动物中心提供，合格证号：吉实动质(2000)042号。实验前在室内常规饲养两天。

1.3方法

1.3.1细胞毒性实验取对数期的L929细胞接种于培养瓶，待细胞生长密度至70%-80%后，消化、离心，并接种于96孔板，置37℃、5% CO2恒温孵箱培养。实验分5组，即：空白组、阳性对照组、和3种不同浓度的大腹园蛛粉组。24 h后取出培养板，分别加入10 μl药物，其中空白对照组加入PBS、阳性对照组加入5%的DMSO、3种不同浓度的大腹园蛛粉组分别加入10 g/L、20 g/L和40 g/L的大腹园蛛粉(Araneus ventricosus powder,AP)。于37℃、5% CO2恒温孵箱中继续培养24 h，然后，取出每孔加入10 μL CCK8，37℃、5% CO2恒温孵箱孵育2 h。最后，用酶标仪在450 nm波长处测各孔OD殖，计算细胞百分数(RGR)[6]。

1.3.2小鼠嗜多染红细胞的微核实验选用昆明小鼠50只，体重18-22 g，雌雄各半，随机分5组，即空白对照组(蒸馏水)、阳性对照组(0.06 g/kg环磷酰胺)、2.5 g/kg、5 g/kg、10 g/kg的大腹园蛛粉组，每组10只。小鼠每天灌胃染毒一次，灌胃剂量为0.2 mL/10 g,连续4 d。第5 d处死小鼠，取出胸骨，剃净肌肉，除尽血污，横向剪短胸骨，暴露骨髓腔并挤出骨髓。加一滴小牛血清并均匀涂在载玻片上。于室温晾干后放入甲醇固定15 min，取出自然晾干，用Geimsa染色15 min后镜检。每张片计数1 000个嗜多染红细胞，计算出含有微核的嗜多染红细胞微核率，以千分率(‰)表示[7]。嗜多染红细胞微核率(‰)=含微核的嗜多染红细胞数/嗜多染红细胞总数×1000。

1.3.3小鼠精子畸形实验选用健康昆明雄性小鼠50只，体重18-22 g，6-8周龄。随机分5组，即：空白对照组(蒸馏水)、阳性对照组(0.04 g/kg环磷酰胺)、2.5 g/kg、5.0 g/kg、10 g/kg的大腹园蛛粉组，每组10只。小鼠每天灌胃染毒一次，灌胃剂量为0.2 mL/10 g,连续5 d。从染毒起第35 d脱颈处死小鼠，取两侧副睾剪碎、涂片、染色。在显微镜下观察结构完整的1 000个精子，并根据精子质量标准，记录其中畸形的精子数目,计算精子畸形率，以百分率(%)表示[9,11]。精子畸形率(%)=畸形精子数/精子总数×100。

2　结果

2.1大腹园蛛粉对细胞毒性影响

实验结果如表1所示，阳性对照组(DMSO)细胞的相对增殖率为22%，而10 g/L、20 g/L和40 g/L的大腹园蛛粉组(AP)的相对增殖率分别为99%、94%和135%，根据细胞毒性反应分级评价标准，阳性对照组为四级毒性，而3个大腹园蛛粉组都属于一级毒。

表1　大腹园蛛粉对l929细胞毒性影响

2.2大腹园蛛粉对小鼠嗜多染红细胞微核影响

各实验组小鼠在给药期间，生长状态均无异常。以2.5 g/kg、5.0 g/kg和10 g/kg的大腹园蛛粉分别给小鼠灌胃染毒后，小鼠嗜多染红细胞(PEC)的微核率分别为2.5‰、2.6‰和2.3‰。与空白对照(蒸馏水)组比较，差异不显著(P>0.05)，而与阳性对照(环磷酰胺)组比较，差异极显著(P<0.01),阳性对照组C环磷酰胺组与空白对照(蒸馏水)组比较，具有极显著差异(P<0.01)表明大腹园蛛粉不能诱发小鼠PEC微核率的增加。具体实验结果如表2所示。

表2　大腹园蛛粉对小鼠骨髓PCE 微核影响

注：与蒸馏水组比较，*P<0.01;与环磷酰胺组比较，#P<0.01。

2.3大腹园蛛粉对小鼠精子畸形的影响

实验结果如表3所显示，2.5 g/kg、5.0 g/kg和10 g/kg的大腹园蛛粉(AP)分别给小鼠灌胃染毒后，小数的精子畸形率分别为2.4%，2.4%，2.7%，与空白对照组相比无统计学差异(P>0.05)，而与阳性对照(环磷酰胺)组相比，具有极显著差异(P<0.01)。阳性对照(环磷酰胺)组与空白对照(蒸馏水)组比较，具有极显著差异(P<0.01)。表明大腹园蛛粉对小鼠的生殖无致突变作用。

表3　大腹园蛛粉对小鼠精子畸形影响

注：与蒸馏水组比较，*P<0.01；与环磷酰胺组比较，#P<0.01。

3　讨论

近年来，随着科学和时代的进步，不少国家逐渐把眼光放到昆虫类药物及保健的开发上。美国盐湖城自然产品公司以蜘蛛为原料已经开发出了很多的新药。以蜘蛛干品为原料的蜘蛛粉、蜘蛛羹目前也已风靡全球，广受人们喜爱。虽然大腹园蛛在中药及饮食保健方面均有应用，但由于其本身是有毒类动物，其毒性大小及对人的毒性反应尚未有报道，这严重阻碍了对其进一步深入开发。本文从细胞毒性、遗传毒、生殖毒三个角度来探究大腹园蛛的毒性，为大腹园蛛的药物开发应用提供实验证据。

细胞毒性试验是一类在离体状态下，模拟体内生存环境，检测外来物质接触机体组织后生物学反应的实验。通过体外细胞毒性试验，可以检测供试品接触细胞后，细胞的形态和功能变化、细胞溶解、细胞生长及死亡等毒性反应[6]。为评价大腹园蛛粉对细胞产生的毒性作用，本文选取对数生长期的L929细胞作为靶细胞，采用国家GB/T14233.2-2005规定方法进行检测。实验结果显示，大腹园蛛粉的毒性反应为1级，为不具有细胞毒性成分。

小鼠骨髓嗜多染微核实验是急性毒性常用的一种检测方式，是检测体外物质对染色质损伤的重要方法[7]。该方法能快速和简便地检测染色体损伤。微核试验因其灵敏、稳定，且能检测染色体完整性改变和染色体分离改变而在毒理上得到广泛应用[8]。微核试验的目的主要是通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞的微核出现率，间接反映骨髓细胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受试物是否具有致突变作用[8-10]。本实验结果证实，大腹园蛛粉的三个剂量组与空白对照组相比均无显著差异(P>0.05)，表明大腹园蛛粉对小鼠骨髓细胞微核没有影响，无致突变作用。

小鼠精子畸形实验是检测物质是否具有遗传毒性的重要方法。虽然人或哺乳动物的精液中可能含有畸形的精子，但在精原细胞后期和精母细胞早期，会对化学诱变剂较为敏感。在此期间给药可提高精子畸形的突变率。因此可以用检查雄性动物接触化学毒物后的精子畸形率高低，判断该化学毒物的生殖毒性和对生殖细胞潜在的致突变性[11，12]。本实验研究结果证实，大腹园蛛粉的3个剂量组与空白对照组相比均无显著性差异(P>0.05)，表明大腹园蛛粉对小鼠的精子无致畸作用。

本文的研究结果证明，大腹园蛛粉属无毒物，不能影响小鼠的生殖和遗传特征。本研究结果不仅为大腹园蛛今后的药物开发研究提供理论和实验依据，而且也为其食品开发奠定了实验基础。

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吉林省自然科学基金资助(201215058)

，注：张逸鹤，韩旭具有同等贡献。

1007-4287(2016)08-1243-03

2016-03-22)