PDTC联合依达拉奉干预下血管性痴呆大鼠脑内MCP-1的相关变化研究

吕晓民,高吉国，周春奎，赵　腾*

(1.吉林大学第一医院 神经内科，吉林 长春130021;2.吉林大学第一医院二部 神经内科，吉林 长春130031)



PDTC联合依达拉奉干预下血管性痴呆大鼠脑内MCP-1的相关变化研究

吕晓民1,高吉国2，周春奎2，赵腾2*

(1.吉林大学第一医院 神经内科，吉林 长春130021;2.吉林大学第一医院二部 神经内科，吉林 长春130031)

目的探讨PDTC联合依达拉奉干预是否可以通过抑制MCP-1所介导的炎症反应来减轻慢性缺血所致大鼠的认知功能损害。方法选用Wistar大鼠60只，随机分为假手术组、模型组、药物干预1、2、3组。采用双侧颈总动脉永久结扎法(2VO)制备慢性前脑缺血致血管性痴呆动物模型，术后分别用PDTC、依达拉奉以及PDTC联合依达拉奉对药物干预组大鼠进行干预。采用Morris水迷宫对各组大鼠的认知功能进行检测。术后60天应用ELISA方法检测各组大鼠脑内MCP-1的表达。结果造模后60天模型组、药物干预1、2、3组大鼠水迷宫的逃避潜伏期时间与假手术组相比存在明显差异，药物干预1组及3组分别与模型组相比也存在显著差异(P<0.05)；经ELISA检测，假手术组、模型组、药物干预1组、药物干预2组、药物干预3组大鼠脑内MCP-1浓度分别为(1.58±0.21)ng/mL、(8.15±1.92)ng/mL、(5.12±1.13)ng/mL、(7.02±1.83)ng/mL、(2.96±0.56)ng/mL。药物干预1组、3组分别与模型组相比，t分别为2.256、4.127，差异有显著性(P<0.05)；药物干预3组分别与药物干预1组及药物干预2组相比，t分别为1.974、3.562，差异均有显著性(P<0.05)。结论依达拉奉联合PDTC可能通过不同的途径来对MCP-1的表达产生抑制，从而间接抑制MCP-1所介导的炎症反应，对血管性痴呆大鼠的学习记忆功能产生保护作用。

血管性痴呆；吡咯烷二硫代氨基甲酸盐；依达拉奉；单核细胞趋化蛋白-1

(Chin J Lab Diagn,2016,20:1257)

血管性痴呆(vasculardementia,VD)是指由脑血管疾病引起的脑损害所致的严重认知障碍。目前有研究显示脑缺血后脑血流量下降所致的脑内炎症反应在血管性痴呆的发病中起到关键的作用。单核细胞趋化蛋白-1(monocytechemotacticprotein-1，MCP-1)作为一种炎症趋化因子，在脑缺血过程中可趋化和激活T淋巴细胞、单核细胞等免疫细胞，同时可活化神经胶质细胞，从而对神经细胞造成损伤。MCP-1的表达可受多种因素的调节，吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)和自由基清除剂可以在不同的途径对MCP-1的表达产生调控[1]。因此，应用PDTC和依达拉奉作为干预剂可能会抑制MCP-1的表达。本研究通过应用PDTC和依达拉奉进行干预，对慢性缺血致血管性痴呆大鼠脑内MCP-1的相关表达进行研究，旨在明确依达拉奉联合PDTC是否可以通过对MCP-1介导的炎症反应的影响来减轻脑缺血后的神经损伤，从而参与对认知功能的保护。

1　材料和方法

1.1实验动物

选取雄性Wistar大鼠60只(体重250-300g,鼠龄2-3个月)，由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供及喂养，实验动物生产许可证:SCXK(吉)2014-0006，实验动物使用许可证:SYXK(吉)2014-0022，动物实验在吉林大学基础实验室进行。

1.2模型制备及药物干预

在分组之前对大鼠先进行Morris水迷宫检测。60只大鼠平均逃避潜伏期为 31.85±9.23s。将大鼠随机分为假手术对照组(12只),模型组(12只)，药物干预1(12只),药物干预2组(12只)，药物干预3组(12只)。采用双侧颈总动脉持久性结扎法(2VO)复制慢性前脑缺血致血管性痴呆的动物模型。假手术对照组除不结扎、不剪断颈总动脉,其余过程与模型组及药物干预组相同。

造模后，给予药物干预1组每3天腹腔注射PDTC(碧云天生物技术研究所)(50mg/kg)，药物注射间隔的2天每天注射等量生理盐水1次。药物干预2组每天腹腔注射依达拉奉(南京先声制药)(6mg/kg)，药物干预3组腹腔同时注射PDTC及依达拉奉，方法同前两组。假手术组及模型组每天给予等量的生理盐水腹腔注射。造模后60天，分别对假手术组、模型组、药物干预1、2、3组进行水迷宫试验，再次记录各组的逃避潜伏期时间。

1.3MCP-1的方法测定

水迷宫测试后，将假手术组、模型组及药物干预组大鼠断头取脑，提取脑组织匀浆，根据ELISA试剂盒提供的方法进行脑组织MCP-1检测。

1.4统计方法

2　结果

2.1Morris水迷宫试验结果

经水迷宫试验后假手术组死亡1只，剩余11只，第4d逃避潜伏期均小于20s，未有误入盲端者。模型组死亡4只，符合血管性痴呆标准者8只。药物干预1组死亡1只，第4d逃避潜伏期低于20s者3只，其余8只逃避潜伏期均大于20s，符合血管性痴呆的标准。药物干预2组死亡2只，第4d逃避潜伏期低于20s者3只，其余7只逃避潜伏期均大于20s，符合血管性痴呆的标准。药物干预3组死亡1只，逃避潜伏期低于20s者8只，逃避潜伏期大于20s者3只。

将造模前后大鼠逃避潜伏期时间分别进行对比，发现造模前模型组及药物干预1、2、3组分别与假手术组对比，差异均无显著性(P>0.05)。(见表1)

表1　造模前水迷宫逃避潜伏期比较

表2　造模后水迷宫逃避潜伏期比较±s，s)

造模后，把模型组、药物干预1组、药物干预2组、药物干预3组第64天逃避潜伏期时间与假手术组相比，t分别为3.325、2.215、2.386，差异均有显著性(P<0.05)；药物干预3组第64天逃避潜伏期与假手术组相比，t=1.136,差异无显著性(P>0.05)。药物干预1组与模型组相比，t=1.126，差异无显著性(P>0.05)；药物干预2组与模型组相比，t=0.896，差异无显著性(P<0.05)。

2.2MCP-1检测结果

表3　各组 MCP-1表达的比较

药物干预1组、3组分别与模型组相比，t分别为2.256、4.127，差异有显著性(P<0.05)；而药物干预2组与模型组相比，t=0.586，差异无显著性(P>0.05)。药物干预3组分别与药物干预1组及药物干预2组相比，t分别为1.974、3.562，差异均有显著性(P<0.05)。

3　讨论

血管性痴呆主要是由缺血性、缺氧性、出血性脑血管病等导致脑组织损害引起的，临床以认知功能障碍、学习能力和记忆力衰退以及行为障碍等为主要表现的一组疾病[2]。对于血管性痴呆的发病机制，目前尚无确切定论。目前越来越多的研究显示脑缺血后炎症反应参与了对神经元的损伤，从而对认知功能造成影响[3]。

单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein，MCP-1)是由76个氨基酸残基组成的分子量为15 kD的糖蛋白单链，是具有趋化功能的细胞因子，属于趋化因子中的CC亚族。作为一种重要的炎性趋化因子，MCP-1在正常脑组织中表达很少，但是当脑组织缺血后，脑内星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元等均可以产生大量MCP-1[4]。另一方面，在脑缺血后引起的炎症反应，MCP-1反过来可以介导小胶质细胞及血液中的单核-巨噬细胞向病变的炎症部位聚集，进而可能造成局部脑组织的损伤。既往研究显示,在脑缺血急性期MCP-1多出现一个表达高峰[5，6]。但最近有研究显示[7],在脑缺血后MCP-1会在急性期过后出现第二个表达高峰，并且持续高表达较长时间。另有研究显示[8]，MCP-1的表达随着动脉粥样硬化的严重程度而出现依赖性高表达。我们的试验结果显示在持续缺血60天后，模型组大鼠脑内MCP-1的表达水平明显高于假手术组，也进一步证实了MCP-1在慢性缺血致脑损伤的炎症反应中可能起到关键作用。因此，我们猜测，在MCP-1表达的关键环节进行拮抗，有可能阻碍脑缺血后MCP-1在脑内的表达，从而减轻相关炎症反应对脑组织的损伤。

目前已知在MCP-1基因转录的调控过程中，其可调控区有两个区域可以与NF-κB结合，分别称为κB1、κB2区。这两个区包绕另外一个高敏感区DMS(HS)共同调控MCP-1的表达[1]。因此，作为MCP-1调控的上游核转录因子，NF-κB可以作为MCP-1表达调控的关键节点。一般情况下，NF-κB与其抑制性蛋白(inhibitor κB，IκB)结合在一起，处于非活性状态。当缺血缺氧及自由基等刺激出现时，NF-κB即与IκB分离，从而进入细胞核，发挥其活性。吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)被认为是NF-κB的特异性抑制剂，其主要作用机制是通过抑制IκB的磷酸化，从而抑制其降解，减少NF-κB的亚基P65/P50的入核，从而使其下游信号分子的表达随之下调。因此我们选择PDTC作为干预剂通过抑制NF-κB的活性来下调MCP-1的表达。实验结果显示单独应用PDTC可使慢性缺血大鼠脑内MCP-1的表达较模型组明显降低，且认知功能损害较对照组也明显减轻。除了应用PDTC对NF-κB产生直接抑制外，减少缺血后的NF-κB活化因素可能是抑制MCP-1表达的另外一个途径。自由基过多被认为缺血后神经损伤的一个重要因素，而自由基与NF-κB可以相互促进各自的表达，从而形成正反馈，被认为是缺血后神经损伤的一个重要机制[9]。依达拉奉是最常用的自由基清除剂，因此我们应用依达拉奉作为干预剂，对慢性脑缺血大鼠进行干预，结果显示单独应用依达拉奉可以轻度降低慢性脑缺血大鼠脑内MCP-1的表达，但较模型组无明显统计学意义，且大鼠认知功能较对照组无明显改善。当依达拉奉联合PDTC干预时，慢性缺血大鼠脑内MCP-1表达较对照组显著降低，较单独应用PDTC或单独应用依达拉奉时脑内MCP-1表达下降更为明显，且差异有显著性。另外，联合应用依达拉奉及PDTC组大鼠水迷宫逃避潜伏期时间也较其他各组明显缩短，从而提示该组大鼠认知功能损害较其他各组明显减轻。因此我们认为，依达拉奉和PDTC可以通过不同的途径来对MCP-1的上游调控因子NF-κB产生抑制，从而间接抑制MCP-1的表达。依达拉奉联合PDTC可能就是通过以上对MCP-1的表达抑制机制来减轻慢性缺血致血管性痴呆大鼠脑中炎症反应，从而对大鼠的认知功能产生保护作用。

[1]Kumar SN，Boss JM．Site A of the MCP-1 distal regulatory region functions as a transcriptional modulator through the transcription factor NF1[J].Mol Immunol,2000,37(11):623.

[2]李林昕,董强.从血管性痴呆到血管性认知功能损害[J].中华脑血管病杂志(电子版),2009,3(3):25.

[3]Basu A,Lazovic J,Krady JK,et al.Interleukin-1and the interleukin-1 type 1 receptor are essential for the progressive neurodegeneration that ensues subsequent to a mild hypoxic/ ischemic injury [J].J Cereb Blood Flow Metab,2005,25(1):17.

[4]Paolinelli R,Corada M,Orsenigo F,et al.The molecular basis of the blood brain barrier differentiation and maintenance[J]．Pharmacol Res，2011,63:165.

[5]Abbott NJ,Patabendige AA,Dolman DE,et al.Strcutue and function of the blood-brain Barrier[J].Neurobiol Dis,2010,37:13.

[6]夏英凯,杜怡峰，李运刚.急性脑梗死患者血清MCP-1水平的变化[J]．山东医药,2016,01(56):79.

[7]王敏,曹秉振.慢性低灌注大鼠血清及脑组织中MCP-1及IL-8的表达[J]中风与神经疾病杂志,2012,6(29):506.

[8]李世英,李峥,等.单核细胞趋化蛋白1和血管内皮细胞钙黏蛋白水平与脑梗死进展及颈动脉粥样硬化的关系[J].中华老年心脑血管病杂志，2016,1:87.

[9]Wang J,Si Y,Wu C,et al.Lipopolysaccride promotes lipid accumulation in human adventitial fibrobalsts via TLR4-NF-κB Pathway[J].Lipid in health and disease,2012,(11)1:139.

The study of MCP-1 change in the brain of vascular dementia rats under the intervention of edaravone jointed PDTC

LU Xiao-min,GAO Ji-guo,ZHAO Teng,et al.

(1.Department of Neurology,The First Hospital of Ji Lin University,Changchun 130021,China;2.Department of Neurology,The Part Two of The First Hospital of Ji Lin University,Changchun 130031,China)

ObjectiveToinvestigatewhetheredaravonejointedPDTCcaninhibitinflammatoryresponsemediatedbytheMCP-1toreducethecognitiveimpairmentcausedbychronicischemiainrats.MethodsChoose60maleWistarratsanddividedintomodelgroup,druginterventiongroup1,druginterventiongroup2,druginterventiongroup3andthecontrolgrouprandomly.Applicatedthepermanentligationbilateralcommoncarotidarteriesmethod(2VO)topreparethechronicforebrainischemiaanimalmodelofvasculardementia.Postoperative，intraperitonealinjectedPDTC,edaravoneandedaravonejointedPDTCintodruginterventiongroupratsrespectively.UsingMorriswatermazeoneachgroupratsinbeforeandafteroperationtomeasuretheescapelatencytoresponsethecognitvefunction.UsedofELISAtomeasuretheMCP-1expressioninbrainofeverygroup.ResultsComparedtheescapelatencytimeofdruginterventiongroup1,2,3andmodelratsrespectivelycomparedwithcontrolgroupwithcontrolgroupaftermodelbuilding60days,differencesweresignificant;Druginterventiongroup1and3,respectively,comparedwithmodelgroup,differencesweresignificant.TheMCP-1concentrationofcontrolgroup,modelgroup,druginterventiongroup1,2,3detectedbyELISAwas(1.58±0.21)ng/mL、(8.15±1.92)ng/mL、(5.12±1.13)ng/mL、(7.02±1.83)ng/mL、(2.96±0.56)ng/mLrespectively.Druginterventiongroup1,3,respectively,comparedwithmodelgroupwas2.256,4.127,differencesweresignificant(P<0.05);Druginterventiongroup3,respectively,comparedwithdruginterventiongroup1,2,twas1.974and3.562respectively,differencesweresignificant(P<0.05).ConclusionEdaravonejointedPDTCcaninhibittheexpressionofMCP-1sothattoinhibittheinflammatoryresponseindirectlymediatedbytheMCP- 1,socanprotectthelearningandmemoryfunctionofvasculardementiarats.

vasculardementia；pyrrolidinedithiocarbamate；edaravone；monocytechemotacticprotein-1

1007-4287(2016)08-1257-04

R446.6

A

2015-11-25)