液相色谱质谱联用技术的胶质瘤代谢谱特征研究

兰春光,李　淼,张海凤,勾金瑞,曹靖惠

(吉林大学中日联谊医院 神经外一科，吉林 长春130033)



液相色谱质谱联用技术的胶质瘤代谢谱特征研究

兰春光,李淼,张海凤,勾金瑞,曹靖惠*

(吉林大学中日联谊医院 神经外一科，吉林 长春130033)

脑肿瘤患者一般具有非常低的存活率和高的复发率,成年病人一旦诊断出患有原发恶性脑肿瘤，那么其5 年存活率不足 30%[1-4]。据临床统计资料显示,在所有原发脑肿瘤中,占大部分比例的是胶质瘤(如星形细胞瘤和胶质母细胞瘤)病例，约占 45%,其发病率大约在十万分之五到十万分之十[5].并且因其部位的特殊性，造成诊断困难，易复发而且难以治愈。因此,及早发现和准确诊断肿瘤对于确定肿瘤正确的治疗方案至关重要。

现今,脑肿瘤的临床诊断主要是依靠肿瘤组织形态学的病理检查以及X-射线计算机断层成像术(CT)[6]、磁共振成像(MRI)[7,8]和正电子发射成像(PET)[9,10]等一些现代诊断技术。这写检查是目前确定肿瘤病人正确治疗方案最基本的技术手段，在脑肿瘤的临床诊断和研究中已得到越来越广泛的应用。但是，这些技术只能作为病理诊断的辅助手段，只能提供肿瘤大小、生长方位等一些信息的确认和评价，因此，寻找新的诊断胶质瘤的方法是目前的重点。

代谢组学(metabonomics)是研究生物体系内源性代谢物质受刺激或扰动后其种类、数量及变化规律的科学，它研究的是生物整体、系统或器官的内源性代谢物质受到内在或外在因素影响时所产生变化规律以及代谢途径。代谢组学作为一门新兴热门的“组学”技术，是系统生物学的一个重要分支，已在全球范围内展示出强劲的发展势头。目前，代谢组学已经有了广泛的应用，如在发现生物标记物[10]、疾病早期诊断[11]、发病机制的研究[12]、及药理药效的评价等方面[13]，并且在恶性肿瘤[14,15]、心脏病[16,17]、糖尿病[18,19]等重大疾病研究当中已经很成熟了。

本研究通过应用高效液相色谱质谱联用技术对25例神经胶质瘤患者以及25例健康志愿者的尿液进行代谢组学分析，以找到可以对神经胶质瘤进行诊断的潜在生物标志物。

1　材料与方法

1.1样本来源及处理

本研究中应用的尿液样本来自吉林大学2014年8月-2015年2月住院的25例初次诊断为胶质瘤并未经任何治疗的患者以及25例健康志愿者，研究对象的年龄、性别基本特征如表1，并未发现两组之间年龄与性别存在差异。所有受试者均在充分告知研究详情后签署知情同意书。所有胶质瘤患者均有病理明确诊断为胶质瘤。所有受试者均于空腹清晨留取尿液样本，尿样采集后即以3 500 r/min离心2 min，去掉杂质后于-80℃下冰冻保存备用。将样本从-80℃冰箱中取出，室温下溶解。先由所有样本(包括实验组和对照组)中各取50 μl混合在一起，配成质量控制组(Quality Control，QC)。每个样本(包括实验组、对照组和QC组)各取100 μl，然后各加入乙腈500 μl，涡旋混匀后，4℃、14 000 r/min离心5 min，取上清液供 LC-MS 分析。

1.2材料

表1　研究对象年龄、性别基本特征

乙腈(西格玛奥德里奇上海有限公司)甲酸(西格玛奥德里奇上海有限公司)质谱校机液(美国ABSciex公司)超纯水(由Milli-Q超纯水机制备)HPLC色谱柱(美国Agilent公司)Agilent快速分离液相色谱系统(美国Agilent公司)ABSciexTripleTOF5600质谱仪(美国ABSciex公司)LD5-2A低速离心机(北京医用离心机厂)LR16-A高速冰冻离心机(北京雷勃尔离心机有限公司)KQ-250DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)QL-901微型漩涡混合器(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)

1.3分析条件

1.3.1色谱条件

色谱柱： Agilent Eclipse Plus C18 (2.1×150 mm，3.5 μm，Agilent，USA)。柱温：45℃。进样量：20 μl。实验中流动相为：正离子：流动相A：水+0.1%甲酸；流动相B：乙腈+0.1%甲酸；负离子：流动相A：水；流动相B：乙腈；实验前将流动相置于KQ-250DE数控超声波清洗器中超声，排净气体，以防影响实验结果。

表2　梯度洗脱程序

1.3.2质谱条件用电喷雾离子化正、负离子采集模式(ESI+、ESI-)，毛细管电喷雾电压:3.5 kV;雾化气(NZ) :30 psi;干燥气(NZ):流速10.0 L/min:温度350 ℃。

2　结果

2.1主成分分析 PCA

本实验通过LC-MS得到尿液样本的数据，将其结果导入MarkerView商业软件。实验中首先对数据采用了主成分分析(PCA)进行比较，观察两组样本是否存在差异。其得分图(Score plot)如图1和2所示，图中的每一个点代表一个样本，可以看到样本分成3个部分，黑色的代表健康人的样本，蓝色的代表胶质瘤患者的样本红色的代表质量监控组。从正负离子模式下的得分图上看，癌症组与正常组的分布均能较好的分离开来，表示两组之间的代谢存在明显的差异，且组内差异较小。

(■) 胶质瘤患者，(*)健康人，(▷)质量监控组

(■)胶质瘤患者，(*)健康人，(▷)质量监控组

2.2t检验

再次将处理后的数据使用MarkerView商业软件对胶质瘤患者和健康对照进行t检验分析，得到正、负离子模式下尿液样本中有差异的代谢产物。在正离子模式下获得 54个存在显著差异(P<0.05)的代谢物；在负离子模式下获得90个存在显著性差异(P<0.05)的代谢物。

2.3聚类分析

将t检验结果中P<0.05的代谢物进行聚类分析，结果如图3所示。图中横向代表各个样本，C为健康人组样本，T为胶质瘤组样本，纵向表示的是具有差异的(P<0.05)代谢物的质核比。从图中可以看到，这些差异代谢物具有良好的将胶质瘤组与健康人组区分开的能力。

图3尿液样本差异代谢物的聚类分析结果

2.4偏最小二乘判别分析PLS-DA

为了进一步寻找与胶质瘤高度相关的差异代谢产物，本实验又使用simca_p软件应用有监督模式识别方法PLS-DA进行建模，对P值小于0.05的代谢物进行进一步分析，得到了很高的模型解释率(R2Ycum=0.894)和判别率(Q2Ycum=0.820)，得到其得分图和VIP图，图4为PLS-DA得分图，黑色的Class 1代表胶质瘤组，红色的Class 2代表健康人组，从图中可以看到，胶质瘤组与健康人组很好的区分开，为了从该模型中寻找与胶质瘤高度相关的差异代谢产物，本实验得到该模型的VIP图，根据VIP值的结果，选取VIP>1的代谢产物共69种，为高度相关的差异代谢产物进行结构鉴定，正离子模式下共16种，负离子模式下共53种。

A：得分图，黑色的Class 1代表胶质瘤组，红色的Class 2代表健康人组；B：各代谢物重要性图(VIP)

图4尿液样本PLS-DA结果

2.5代谢物结构鉴定

将找到的生物标志物导入HMDB数据库，进行结构鉴定。在HMDB数据库中找到正离子模式下的生物标志物8种，负离子模式下的生物标志物11种。具体如表3所示。

3　讨论

众所周知,由于恶性脑肿瘤病人存活率较低,使得肿瘤的早发现对于确定肿瘤最佳治疗方案和预后有着极其重要的作用。为了寻找对人体创伤小，灵敏度高、特异性好的检查方法，本研究采用液相色谱质谱联用的代谢组学分析技术，对胶质瘤患者与健康人的尿液为进行分析，将得到的数据进行主成份分析以及聚类分析，结果显示可以很好的对两组进行区分，说明两组的样本具有很好的差异性，经过进一步的偏最小二乘判别分析以及结构鉴定，最终找到了19种具有明显差异的代谢产物，其中大多数为氨基酸类物质，其余的则为myo-Inositol ， lactate等已报导与肿瘤代谢相关的代谢产物。

表3　代谢物结构鉴定

从结果中可以看出，胶质瘤患者与健康人的代谢模式差别主要反映在氨基酸代谢及能量代谢上。有人对脑肿瘤患者的肿瘤组织代谢情况进行磁共振分析，发现丙氨酸、甘氨酸等浓度与肿瘤的恶性程度有关[20-22]。

本研究中发现丙氨酸等代谢产物的浓度在胶质瘤患者的尿液中的浓度明显高于健康人，与前人研究结果相似。本研究中还发现牛磺酸代谢产物，牛磺酸具有抗肿瘤作用，有研究表明[23]乳腺癌患者血清中牛磺酸的浓度明显降低，与本研究结果相似，提示牛磺酸浓度的降低可能与肿瘤的抗凋亡能力增强有关，因此牛磺酸的降低可能为患有恶性肿瘤的标志，但也有研究表明，膀胱癌患者尿液中牛磺酸的水平明显升高[24]。本研究结果中发现柠檬酸在胶质瘤患者的尿液中含量比健康人的多，我们推测胶质瘤患者肿瘤细胞的有氧代谢受阻，考虑与肿瘤细胞处于缺氧状态有关。本研究还发现亮氨酸、缬氨酸、醋酸盐等物质的改变，这些物质没有发现与肿瘤发生的相关报导与研究，可能为胶质瘤特异的改变。本研究中偏最小二乘判别分析结果中VIP值大于1的共有69种，最后鉴别出结构的代谢产物只有19种，基于此种情况，考虑HMDB数据库还需进一步完善。

综上，本研究中找到的代谢产物具有区分胶质瘤与健康人的能力，可能为潜在的标志物对胶质瘤进行诊断，但由于样本量较少，为了进一步验证，还需要进行大样本的研究。

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2015-08-16)