96gp负载树突状细胞联合化疗抗耐药卵巢癌的研究

杨淑莉，司丽慧，吴　琦，马语红，林瑞新

(吉林大学第二医院，吉林 长春130041)



96gp负载树突状细胞联合化疗抗耐药卵巢癌的研究

杨淑莉，司丽慧，吴琦，马语红，林瑞新*

(吉林大学第二医院，吉林 长春130041)

目的探讨96gp负载树突状细胞联合化疗抗耐药卵巢癌的效果。方法使用树突状细胞中的96gp多肽复合物作为抗原来刺激树突细胞从而增加抗原递呈作用，加大对卵巢癌细胞的杀伤力，为临床治疗卵巢恶性肿瘤提供依据。选取一定的人卵巢癌细胞(SKOV3)和耐药卵巢癌细胞(SKOV3/DDP)，从中提取gp96多肽复合物，对其进行鉴定，然后使用脐血将树突细胞(DC)诱导后进行培养，待细胞成熟后将其和gp96相结合制成gp96-DC复合物，然后分别将一般DC和载有抗原的DC分别与脐血有核细胞、人外周血T淋巴细胞相结合，比较分析两者对卵巢癌细胞和耐药卵巢癌细胞的杀伤作用效果。结果gp96为热休克蛋白，它与DC结合后的抗原树突细胞对卵巢癌以及耐药卵巢癌细胞的杀伤作用更大，单纯DC对两种癌细胞杀伤力较弱。结论gp96-DC在卵巢癌细胞和耐药卵巢癌细胞中有很强的杀伤作用，为临床卵巢癌的治疗提供科学依据。

热休克蛋白；gp96-肽复合物；树突状细胞；卵巢癌细胞；耐药卵巢癌细胞

(ChinJLabDiagn,2016,20:1267)

卵巢癌在妇科的恶性肿瘤中属于发病率较高、较为常见的疾病，5年内的生存率仅达20%-30%[1]。卵巢癌的高死亡率、发现晚并且预后差的特点严重危害了广大女性的身体健康。卵巢癌的发病率占女性妇科恶性肿瘤疾病的20%左右[2]。死亡率在其他恶性肿瘤中排名第一。随着医疗技术的发展，致癌因素的增加，但具体的发病原因尚未得到确切的理论认证，所以一些学者将研究热点转移到从肿瘤组织细胞中提取一种gp96的多肽物质，该物质为热休克蛋白[3]，通过该抗原提取物和树突细胞结合参与卵巢癌细胞的治疗当中，探讨其杀伤癌细胞的作用效果，现报告如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

本次实验所用的脐带血来自于我院足月分娩的产妇，将脐带血收集后放入无菌的真空血袋中，血袋提前加入抗凝剂，密封好后于4℃冰箱里存储24 h。而实验所需要的人体卵巢癌细胞以及耐药卵巢癌细胞的样本来源于中国科学院上海生命科学研究院。实验应用层析法提取蛋白质所需的试剂来源于美国Phamacia公司[4]，电泳试剂来源于Sigma公司，gp96检测所使用的试剂来源于MBL公司，淋巴细胞的分离液来源于中国医学科学院血研所科技公司。

1.2方法

1.2.1从卵巢癌细胞中提取gp96-肽复合物(1)将卵巢癌的细胞株浓度调为1×109/ ml，使用加热器加热至43℃，放置2 h后，再将细胞株重新加热至37℃，放置2 h。(2)将加热后的细胞株放入超声细胞粉碎仪进行粉碎，时间为0.5 h，时间到后取出细胞液体备用。(3)将卵巢癌细胞液离心提取上清液，分别经过0.8、0.65、0.45、0.22 μm这四个不同直径的微孔滤膜过滤，透析、过夜，换液两次后分装备用。(4)裂解后的卵巢癌细胞株，会沉淀出硫酸铵，经过钠盐的洗脱[5]，再使用紫外分光光度计进行浓度的测定。

1.2.2 制备gp96-DC复合物将脐血有核细胞进行分离后加入24孔细胞培养板，2.5 d进行一次换液，4d后将DC分为2组：一组为gp96-DC、另一组为无抗原DC。分别培养，在第3、6、9 d后于显微镜下观察、拍照。比较含有抗原的DC组和不含有抗原的DC组分别对卵巢癌细胞以及耐药卵巢癌细胞的杀伤作用。

1.3统计学分析

采用SPSS 17.0对所得资料进行统计学分析，计量资料采用t检验，计数资料采用卡方检验，两组比较P<0.05表示有显著统计学差异。

2　结果

2.1gp96的鉴定

经过聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析得出，在分子量96 kD有一条清晰的染色带，经过初步的鉴定该色带为热休克蛋白gp96，及从卵巢癌细胞中提取出来的物质就是热休克蛋白gp96。

2.2DC细胞形态学的观察和DC细胞表型分析

在显微镜下观察的第3 d，脐血有核细胞聚集后形成细胞聚体，一部分细胞成为聚体后会变形、拉长，观察的第9 d发现明显的树枝状凸起的树突细胞，疏松的贴壁生长或者悬浮生长，该细胞鉴定为典型的DC细胞。流式细胞仪的作用是鉴定DC培养后的特异性标志物，与DC细胞培养前比较，CD1a、CD83、刺激的分子CD86与MHCⅡ类分子HLA-DR的表达率和平均荧光强度都有很大程度的提高，两组前后比较有显著统计学差异(P<0.01)。

2.3经过激发的DC对肿瘤细胞的杀伤效果

DC经过一定的抗原刺激以后，较之前对肿瘤细胞的杀伤力更强，作用效果更为明显，详见表1。

表1　DC激发脐血有核细胞体外对肿瘤的杀伤作用

注：有核细胞组为对照组，DC+有核细胞组与对照组比较P<0.05；DC+Ag+T细胞组与对照组比较P<0.01；DC+Ag+有核细胞组与DC+有核细胞组比较P<0.01.

2.4经过DC活化后的T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用效果

经过抗原刺激后的DC细胞对肿瘤细胞杀伤力明显增加，而经过DC活化后的T细胞同样对肿瘤细胞有显著的杀伤力，详见表2。

3　讨论

肿瘤组织中的热休克蛋白gp96可以激发抗肿瘤的排斥反应，从而开始诱导机体产生特异性的CTL[6]，将肿瘤细胞杀除。gp96与免疫抗原相结合成为多肽复合物后，对癌细胞杀伤作用更强。DC属于抗原提呈细胞，它的抗原提呈功能最强[7]，在抗原细胞和免疫应答细胞之间充当桥梁的作用，DC分泌细胞因子、抗原肽小体，根据需要进行体内的免疫调节。gp96与DC结合后，大大减少了溶酶体的降解作用，从而保存了gp96的完整性[8]，对CD8+T细胞有直接激活作用，gp96在抗原提呈这一过程中成为关键因素。

脐带血的有核细胞经过抗原提呈以后，对卵巢细胞和耐药卵巢细胞有一定的杀伤作用。DC刺激脐带血有核细胞以后，它的杀伤活性更甚[9]，两组比较有明显的统计学差异；而gp96-DC要比单纯DC杀伤力更强，实验结果中可以看出，二者对肿瘤细胞杀伤作用有显著的统计学差异。通过脐带血有核细胞的杀伤效果中可以推断出卵巢癌患者以及耐药卵巢癌患者究竟是否可以输入脐血，是否可以通过对带有热休克蛋白gp96抗原的DC进行刺激来实施临床的免疫法治疗卵巢癌患者和耐药卵巢癌患者。研究显示[10]，脐带血有核细胞可以被体内的DC所刺激从而变成有杀伤力的效应细胞，对卵巢癌细胞进行杀除，这一作用机理尚未得到确切理论说明。

表2　经过DC活化后的T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用

注：T细胞组为对照组，DC+T细胞组与对照组比较P<0.05；DC+Ag+T细胞组与对照组比较P<0.01；DC+Ag+T细胞组与DC+T细胞组比较P<0.05.

Gp96-肽复合物致敏的DC能够活化卵巢癌细胞外周血的T淋巴细胞，从而对肿瘤细胞产生杀伤性。gp96-DC要比单纯的DC杀伤效果更好，其原因在于T细胞活化后可以提高杀伤力[11]，DC还具有激活靶细胞的能力，这一研究结果为日后DC疫苗研发提供科学的理论依据，针对长期化疗后耐药的卵巢癌患者，gp96-DC疫苗的研发最适合[12]。

综上所述，gp96-DC比单纯DC作用卵巢癌细胞效果更强、更为有效。免疫治疗在卵巢癌细胞和耐药卵巢癌细胞治疗上已经取得了一定程度的进展，它的关键核心在于解决卵巢癌患者耐药性，gp96-DC疫苗将成为未来新的课题方向。

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Study of 96gp dendritic cells loaded with chemotherapy resistant ovarian cancer

YANG Shu-li,SI Li-hui,WU Qi,et al.

(TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China)

ObjectiveTo investigate the 96gp pulsed dendritic cells combined with chemotherapy resistant ovarian cancer effect.Methodsuse of dendritic cells in the 96gp peptide complexes as anti the original stimulus dendritic cells and antigen presentation function，increase the lethality of ovarian cancer cells，so as to provide basis for clinical treatment of ovarian malignant tumor.Selection of human ovarian cancer cells SKOV3 and resistant ovarian cancer cells (SKOV3/DDP)，from extraction gp96 peptide complexes，carries on the appraisal，and the use of umbilical cord blood dendritic cells (DC) after induction were cultured，until the mature cells will gp96 and its combination made gp96-DC complex，then the general DC and carrying of dendritic cell (DC) respectively and umbilical cord blood have combination of nuclear cells and human peripheral blood T lymphocytes，a comparative analysis of both on ovarian cancer cells and resistant ovarian cancer cell killing effects.Resultsgp96 heat shock protein，it combined with DC after antigen dendritic cells in ovarian cancer and the killing effect of resistant ovarian cancer cells more，with DC of two cancer cells lethal weak.Conclusiongp96-DC has strong killing effect on ovarian cancer cells and ovarian cancer cells，provide scientific basis for clinical treatment of ovarian cancer.

heat shock protein;gp96- peptide complex;dendritic cells;ovarian cancer;ovarian cancer cells

吉林省卫生厅课题(2009Z065)

1007-4287(2016)08-1267-03

R737.31

A

2016-03-15)