葡萄糖激酶基因3个标签单核苷酸多态性位点与2型糖尿病的相关性研究*

张秀明,孙各琴,罗楚君,李晶晶,韩　慧,陈　琼

(1.广东省深圳市罗湖医院集团医学检验中心　518000;2.中山大学附属中山医院，广东中山 528403)



葡萄糖激酶基因3个标签单核苷酸多态性位点与2型糖尿病的相关性研究*

张秀明1,孙各琴2,罗楚君2,李晶晶2,韩慧2,陈琼2

(1.广东省深圳市罗湖医院集团医学检验中心518000;2.中山大学附属中山医院，广东中山 528403)

目的探讨葡萄糖激酶(GCK)基因3个标签单核苷酸多态性(tagSNPs)位点rs2971672、rs2268573、rs2300587与2型糖尿病的关系。方法选取2013年8月至2014年12月在中山大学附属中山医院住院的中国南方汉族2型糖尿病患者499例(2型糖尿病组)，同时选择同期在该院康体保健中心体检的汉族健康人499例作为对照组，对GCK基因的3个tagSNPs位点采用改良多重高温连接酶检测反应技术(iMLDR)进行基因分型，应用Hardy-Weinberg平衡规律检测标本代表性，采用χ2检验、Logistic回归分析比较2型糖尿病组和对照组基因型和等位基因频率的差异，并在加性、显性和隐性3种遗传模型下对各SNP位点进行相关性分析。应用Haploview软件构建GCK基因3个tagSNPs位点的单体型，分析是否存在连锁不平衡(LD)及不同的GCK单体型与2型糖尿病易感性的关系。结果rs2268573、rs2300587的基因型(χ2=3.361、2.076，均P>0.05)和等位基因频率(χ2=0.222、1.980，均P>0.05)在2型糖尿病组和对照组之间差异均无统计学意义。rs2971672的基因型(χ2=6.896，P<0.01)和等位基因分布(χ2=4.708，P<0.05)在2型糖尿病组和对照组之间差异有统计学意义。在显性遗传模式下以及在加性遗传模式下，rs2971672的基因型分布在2型糖尿病组和对照组之间的差异有统计学意义(显性遗传模式下OR=1.74，95%CI：1.17～2.57，P<0.01；加性遗传模式下OR=1.51，95%CI：1.06～2.14，P<0.05)。GCK基因3个位点中的rs2971672和rs2300587有一个LD域，其中TC、TA、CA3种主要单体型，单体型TA和CA均降低个体患2型糖尿病的风险，OR值分别为0.81(95%CI:0.66～1.00，P<0.05)和0.78(95%CI:0.62～0.98，P<0.05)。结论在汉族人群中，GCK基因区域的rs2971672位点与糖尿病遗传易感性密切相关，而rs2268573、rs2300587位点与糖尿病遗传易感性无明确相关性。rs2971672和rs2300587的LD域单体型TA和CA均降低个体患2型糖尿病的风险。

2型糖尿病；基因；葡萄糖激酶；多态性，单核苷酸

糖尿病是一组由胰岛素分泌不足或新陈代谢紊乱所导致的高血糖病。据估计，2013年在中国就有9 800万糖尿病患者，居世界首位[1]。遗传因素在糖尿病的发生和发展中起重要作用。全基因组关联研究(GWAS)是一种通过对大规模人群进行测试、统计，从而发现与疾病表型或相关性状关联的遗传位点的关联研究[2]，一般以单核苷酸多态性(SNPs)作为标记物[3]。近年来，GWAS候选基因方法已被广泛用于解释糖尿病的遗传基础[4]，并发现了多个与糖尿病相关的基因[5]。但是，糖尿病相关的基因数目和特性、潜在的遗传模型以及与环境因素的相互作用还不清楚[6]。葡萄糖激酶(GCK)是糖酵解的关键酶，也是通过β细胞维持葡萄糖自身稳定的传感器[7]。GCK基因位于7号染色体(7p15.3-p15.1)上，由12个外显子组成，编码由465个氨基酸组成的蛋白质[8]。通过对GCK基因的标签单核苷酸多态性(tagSNPs)网上系统分析和文献查阅，与糖尿病相关的GCK基因3个tagSNPs位点rs2971672、rs2268573、rs2300587引起了笔者的关注。因此，本研究对GCK基因上的这3个位点与中国汉族人2型糖尿病易感性的关系进行探讨。

1　资料与方法

1.1一般资料选取2013年8月至2014年12月在中山大学附属中山医院诊治的2型糖尿病患者499例(2型糖尿病组)，均符合1999年WHO糖尿病诊断标准[9]，其中男257例、女242例，年龄28～93岁、平均58.6岁。另取同期体检健康者499例作为对照组，其中男290例、女209例，年龄27～86岁、平均55.7岁。本研究已通过医院伦理委员会审核，患者均签署知情同意书。

1.2仪器与试剂DU800核酸检测仪、5415D高速离心机(德国Eppendof公司)，DYY-6B型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)，UVP凝胶成像系统(美国UVP公司)，血液基因组提取试剂盒(Gentra Puregene Blood Kit，美国Qiagen公司)。

1.3方法

1.3.1标本采集入选者知情同意后签字，分别抽取静脉血5 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，室温放置15 min，2 000 r/min离心10 min，吸取上层血浆，有核细胞层经红细胞裂解液处理后，置-70 ℃低温冰箱保存备用。

1.3.2基因组DNA提取采用Gentra Puregene Blood Kit基因组提取试剂盒，提取标本外周血白细胞基因组DNA，DNA 标本经1%琼脂糖凝胶电泳对其进行完整度检查，核酸检测仪测定浓度，并将标本DNA稀释到工作浓度(5～10 ng/L)。

1.3.3基因检测SNP位点的检测使用改良多重高温连接酶检测反应技术(iMLDR)，所需PCR扩增引物和多重单碱基延伸反应延伸引物(表1)均由上海天昊生物科技有限公司设计，上海生工生物科技有限公司合成，按要求稀释到指定浓度。由于待测的SNP附近有其他高频的SNP，设计连接引物时因为必须紧挨目的位点，所以必定要覆盖到这些附近的SNP，因此在设计连接引物时两种碱基都合成，这样才不会因为只设计其中一种而另一种多态的染色体因为和引物存在错配而效率低甚至不出现碱基峰从而导致基因型判读错误。分型实验委托上海天昊生物科技有限公司进行。反应体系(10 μL)包含：1×GCI buffer，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP，1 U HotStar Taq polymerase，1 μL标本DNA 和1 μL多重PCR引物。PCR循环程序：95 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s、65 ℃和-0.5 ℃/cycle 40 s、72 ℃ 90 s，共11 个循环；94 ℃ 20 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，24个循环；4 ℃ 60 min；在PCR产物中加入试剂盒中的ExoⅠ/SAP酶1 μL，37 ℃温浴1 h，然后75 ℃灭活15 min；取10×连接缓冲液2 μL、高温连接酶0.2 μL、连接引物混合液1 μL与纯化后多重PCR产物3 μL、ddH2O 3.8 μL，混匀。连接程序：94 ℃ 1 min、56 ℃ 4 min，38个循环；4 ℃ 60 min；取0.5 μL稀释后的连接产物，与0.5 μL Liz500 SIZE STANDARD、9 μL HiDi 混匀，95 ℃变性5 min后上ABI 3130 XL 测序仪；收集的原始数据用 Gene Mapper 4.1(美国应用生物系统公司)分析并输出结果。

表1　　扩增SNPs 的引物序列

1.3.4相关定义如果双亲的性状同时在F1个体上表现出来，这种显性表现称为共显性，或叫并显性。显性就是表现出来的特征，隐性是没有表现出来但是自身携带。比如rs2235321(G>A)，G为野生型、A为突变型。共显性模型假设等位基因G和A均显性表达，致病基因型为GA、AA型；显性模型假定突变型A为显性致病基因，致病基因型为GA、AA型；隐性模型假定突变型A为隐性致病基因，致病基因型为AA型；超显性模型假定纯合子不发病而杂合子发病，致病基因型为GA型。

1.4统计学处理运用Hardy-Weinberg平衡规律检测标本代表性；SPSS 17.0统计软件处理基因型和等位基因频率结果，计数资料各百分率比较用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义；运用Haploview软件进行GCK的3个位点tagSNPs单体型的构建；http://bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm在线分析LD，分析是否存在LD及不同的GCK 单体型与2型糖尿病风险的关系。

2　结　　果

2.1候选SNPs基因型与等位基因频率采用iMLDR多重SNP分型试剂盒对998份标本的3个SNP 进行分型。经统计发现所有SNP位点均符合Hardy-Weinberg检验平衡定律，提示所选人群具有较好代表性。通过多变量回归分析，rs2268573、rs2300587的基因型(χ2=3.361、2.076，均P>0.05)和等位基因频率(χ2=0.222、1.980，均P>0.05)在2型糖尿病组和对照组之间差异均无统计学意义，见表2。rs2971672的基因型(χ2=6.896，P<0.01)和等位基因分布(χ2=4.708，P<0.05)在2型糖尿病组和对照组之间差异有统计学意义，提示此位点SNP多态性与2型糖尿病相关，见表2。在显性遗传模式下(OR=1.74，95%CI：1.17～2.57，P<0.01)以及在加性遗传模式下(OR=1.51，95%CI：1.06～2.14，P<0.05)rs2971672的基因型分布在2型糖尿病组和对照组之间差异有统计学意义，见表3，提示此位点在显性和加性遗传模式下与2型糖尿病的易感性相关。

2.2GCK单体型的构建及与2型糖尿病风险的关系运用Haploview软件进行单体型构建。GCK基因3个位点中的2个位点组成LD 域，即rs2971672和rs2300587。GCK的两个位点rs2971672和rs2300587共存在TC、TA、CA 3种主要单体型(表4)，其中两种差异有统计学意义(P<0.05)：单体型TA和CA均降低了个体患2型糖尿病的风险，OR值分别为0.81(95%CI:0.66～1.00，P<0.05)和0.78(95%CI:0.62～0.98，P<0.05)。

表2　　SNPs位点基因型及等位基因分布在2型糖尿病组与对照组之间的分析

表3　　不同遗传背景下各SNP位点分析

表4　　rs2300587 C/T、rs2971672C/A位点配对单体型频率比较

注：-表示无数据。

3　讨　　论

近年来，遗传因素在糖尿病发生和发展中的作用备受关注。已有研究表明，钙蛋白酶10(Calpain-10)基因、KIR6.2基因、HNF-4α基因、TCF7L2基因等与糖尿病的发生和发展相关[10]。本研究通过对GCK基因的tagSNPs网上系统分析和文献查阅，选取GCK基因3个tagSNPs位点rs2971672、rs2268573、rs2300587，探讨其与中国汉族人2型糖尿病风险的关系。本研究在挑选位点时，基于以下两点：(1)在疾病相关基因中，基因编码区、5′非编码区(5′UTR)、3′非编码区(3′UTR)、5′附近的基因(5′near gene)、3′附近的基因(3′near gene)的SNP位点，最小等位基因频率(MAF)一般大于5%，进入美国国家生物技术信息中心(NCBI)的SNP数据库网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，输入目的基因，找出MAF频率大于0.05的多态性位点，这些位点在基因的编码区、5′UTR、3′UTR、5′near gene、3′near gene。同时，注意选择人种，因为不同的人种各SNP的频率是不同的。(2)一个基因上有很多个SNP位点，并且基因上位点间往往是有关联的，可以用一个位点或多个位点的组合代表另外的位点或单体型，所以可以挑选有代表性的位点来代表基因上其他的位点或人群中存在的常见单体型。在选取tagSNPs时主要考虑序列范围(一般常用基因前5 kb和后2 kb)、SNP入选频率标准(MAF≥0.05)和r2标准(r2≥0.8)。

在dbSNP数据库中查询得到：rs2971672位点的MAF值C在非洲裔美国人和中国南方汉族人群分别占0.475和0.461。有文献报道，非洲裔美国人2型糖尿病和2型糖尿病伴发终末期肾病患者，GCK都起着重要作用，但未发现rs2971672位点突变与非洲裔美国人2型糖尿病和2型糖尿病伴发终末期肾病有关[11]。本研究结果显示，GCK位点rs2971672与2型糖尿病有关，在对背景、年龄和性别作出调整后，仍与2型糖尿病相关。在显性遗传模式和加性遗传模式下，rs2971672位点的基因型分布在2型糖尿病组和对照组之间差异有统计学意义(P<0.05)，提示该位点在显性和加性遗传模式下与2型糖尿病的易感性密切相关，可能增加个体患2型糖尿病的风险，但与文献[11]的研究不符，这可能与种族和地区差异有关。此外，有文献还报道印第安人群rs2268573突变与2型糖尿病有相关性[12]，rs2300587则与空腹血糖的水平无关[13]。本研究发现，GCK位点rs2268573和rs2300587等位基因及基因型分布频率与健康人群相比较差异无统计学意义(P>0.05)，与上述研究不完全一致，提示这些基因与糖尿病及糖代谢的关系尚需深入研究。单体型研

究结果显示，SNP位点rs2300587、rs2971672形成LD域，表达显著关联(P<0.05)，表明在这2个SNP位点中有基因-基因相互作用。

总之，本研究初步验证了在汉族人群中，GCK基因区域的rs2971672位点与糖尿病遗传易感性密切相关，而rs2268573、rs2300587位点与糖尿病遗传易感性无明确相关性。rs2300587和rs2971672的LD域有基因-基因相互作用。rs2971672和rs2300587 LD 域单体型TA和CA均降低了个体患2型糖尿病的风险。这些突变基因的作用机制值得深入研究。

[1]刘子杰，晋臻，段勇．HbA1c常规工作中引入测量不确定度的意义和存在的困难[J]．中华检验医学杂志，2014，37(12)：884-886．

[2]朱啸林，宁光．2型糖尿病的全基因组关联研究[J]．中华内分泌代谢杂志，2010，26(12)：1094-1096．

[3]Hardy J,Singleton A.Genomewide association studies and human disease[J].N Engl J Med,2009，360:1759-1768.

[4]Sladek R,Rocheleau G,Rung J,et al.A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes[J].Nature,2007,445(7130):881-885.

[5]Billings LK,Florez JC.The genetics of type 2 diabetes:what have we learned from GWAS? [J].Ann N Y Acad Sci,2010,1212:59-77.

[6]Bao XY,Peng B,Yang MS.Replication study of novel risk variants in six genes with type 2 diabetes and related quantitative traits in the Han Chinese lean individuals[J].Mol Biol Rep,2012,39(3):2447-2454.

[7]Matschinsky F,Liang Y,Kesavan P,et al.Glucokinase as pancreatic beta cell glucose sensor and diabetes gene[J].J Clin Invest,1993,92(5):2092-2098.

[8]Iynedjian PB.Mammalian glucokinase its gene[J].Biochem J,1993,293(1):1-13.

[9]WHO.Definition,diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications.Part 1:Diagnosis and classification of Diabetes Mellitus[S].Geneva：WHO，1999:1-59.

[10]张秀明，黄宪章，曾方银，等．临床生化检验诊断学[M]．北京：人民卫生出版社，2012：866．

[11]Leak TS,Langefeld CD,Keene KL,et al.Chromosome 7p linkage and association study for diabetes related traits and type 2 diabetes in an African-American population enriched for nephropathy[J].BMC Med Genet,2010,11(2):11-22.

[12]Echouffo-Tcheugui JB,Dieffenbach SD,Kengne AP.Added value of novel circulating and genetic biomarkers in type 2 diabetes prediction:A systematic review[J].Diabetes Res Clin Pract,2013,101(3):255-269.

[13]Jansen RJ，Robinson DP，Stolzenberg-Solomon RZ，et al.Polymorphisms in metabolism/antioxidant genes May mediate the effect of dietary intake on pancreatic cancer risk[J].Pancreas,2013,42(7):1043-1053.

Study on relationship between glucokinase gene 3 tag single nucleotide polymorphism sites and type 2 diabetes*

ZHANGXiuming1，SUNGeqin2，LUOChujun2,LIJingjing2，HANHui2，CHENQiong2

(1.MedicalLaboratoryCenter,LuohuHospitalGroup,Shenzhen,Guangdong518000,China;2.AffiliatedZhongshanHospitalofSunYat-senUniversity,Zhongshan,Guangdong528403,China)

ObjectiveTo investigate the relationships between glucokinase(GCK) gene 3 tag single-nucleotide polymorphisms(tagSNPs)sites rs2971672,rs2268573 and rs2300587 polymorphisms with type 2 diabetes (T2DM)．MethodsA total of 499 southern Han inpatients with T2DM(T2DM group) in our hospital and contemporaneous 499 Han individuals undergoing the physical examination(control group) in the Health and Fitness Protection Center of our hospital from August 2013 to December 2014 were chosen.The GCK gene 3 tagSNPs sites in all subjects were genotyped by adopting the improved multiple ligase detection reaction (iMLDR),and the genotype and allele frequency between the T2DM group and healthy controls were compared by the chi-square test,logistic regression analysis,moreover the tagSNPs sites were performed the correlation analysis under three genetic modes(dominant,recessive and additive).The Haploview software was used to construct the haplotype of GCK gene 3 tagSNPs and the linkage disequilibrium(LD) and relationship between various GCK haplotype and T2DM susceptibility was analyzed.ResultsThe differences of rs2268573 and rs2300587 genotypes(χ2=3.361,2.076,P>0.05) and allele frequency(χ2=0.222,1.980,P>0.05) between the T2DM group and the control group were not statistically significant.The difference of rs2971672 genotype(χ2=6.896,P<0.01) and allele distribution(χ2=4.708，P<0.05) between the T2DM group and the control group was statistically significant.Under the dominant genetic model and additive genetic model,the genotype distribution of rs2971672 between the T2DM group and the control group was statistically significant(OR=1.74，95%CI:1.17-2.57，P<0.01;OR=1.51，95%CI:1.06-2.14，P<0.05).Among 3 GCK gene sites,rs2971672 and rs2300587 had the LD domain including 3 main haplotypes of TC,TA and CA3,the TA and CA haplotypes all decreased the risk suffering from T2DM(OR=0.81,95%CI:0.66-1.00,P<0.05;OR=0.78,95%CI:0.62-0.98,P<0.05).ConclusionIn Han population,GCK gene rs2971672 site is closely related with T2DM genetic susceptibility,while rs2268573 and rs2300587 sites have no obvious correlation with T2DM susceptibility.Haplotype TA and CA in rs2971672 and rs2300587 LD domain all reduce the individual risk suffering from T2DM.

type 2 diabetes；gene；glucokinase；polymorphism,single nucleotide

广东省科技计划基金资助项目(2013B02180012)。

张秀明，男，主任技师，主要从事临床化学检验和实验室管理工作。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.003

A

1673-4130(2016)16-2211-04

2016-03-13

2016-06-21)