实时定量PCR在血流感染病原体快速检测中的应用

范世珍，林松青，莫　莉

(广东省深圳市福田区中医院　518034)



实时定量PCR在血流感染病原体快速检测中的应用

范世珍，林松青，莫莉

(广东省深圳市福田区中医院518034)

目的探讨实时定量PCR在血流感染病原体检测中的临床应用价值。方法选取收治的80例患者共92份血液标本进行实时定量PCR检测，同时进行血液培养，比较两种方法的特异度和敏感度。结果在92份标本当中，两种方法共同阴性标本66份(71.7%)，两种方法共检测出病原体10种。实时定量PCR和血培养共同检出阳性标本7例，两种方法的一致性为79.3%。实时定量PCR的阴性预测值是0.94，敏感度是0.64，特异度是0.82。其中15份标本实时定量PCR阳性而血培养阴性，4份标本血培养阳性而实时定量PCR阴性。其中2份标本所培养出的病原体不在实时定量PCR的检测范围内，且实时定量PCR也不能检测光滑念珠菌。结论实时定量PCR是快速检测血液感染标本的有价值方法，但不能完全替代血培养。

血流感染；脓毒血症；实时定量PCR

血流感染常导致严重临床后果，虽然在微生物诊断与抗微生物治疗方面已取得很多进展，但败血症依然在住院患者感染中占有重要比例，在医院内死亡原因中位列第三。美国每年200 000人罹患菌血症，欧洲的研究表明由多重耐药菌引起的医院交叉感染事件也在增多，西班牙的报道显示每1 000例住院患者中就有16～31.2 例存在血流感染。国内的住院患者中，血流感染也常是恶性肿瘤、血液病、脏器移植等免疫功能缺陷患者的重要死因。医院内感染中血流感染致死率高达35%～60%，而在重症监护病房中的患者，血流感染致死率为31.5%～82.4%，平均56%，同时导致患者住院时间延长、住院费用增加。因此，快速检测血液感染病原体并且早期给予抗生素治疗是改善血流感染患者预后最重要的手段。尽管临床上通过经验性给予广谱抗生素治疗，但对于疗效甚微的患者有必要调整治疗手段。目前，全自动的常规血液培养是诊断血流感染的金标准，然而，最终的培养结果往往是需要等待12～48 h。对于营养需求苛刻的病原体(如酵母菌)可能需要更长的时间[1]。此外，若患者先前使用过抗生素，血培养的阳性率一般更低。因此，直接从血液标本中对细菌或真菌的核酸进行扩增是鉴定病原体感染的重要手段[2-4]。本研究通过实时定量PCR技术检测血流感染患者中的病原体，并与常规血培养法进行对比，旨在评价其在临床中的应用价值。

1　资料与方法

1.1一般资料本研究纳入的92份血液标本来自2015年6～9月深圳市福田区中医院80例患者，其中男39例、女41例，平均年龄(45.6±8.5)岁；59例患者(73.8%)来自重症医学科和呼吸内科， 21例(26.3%)来自心血管内科和神经内科；72例患者(90.0%)在采集血液时已经接受过抗菌药物治疗，19例(23.8%)在抽血后24 h内死亡；80例患者中有3例具有全身炎症反应综合征。

1.2方法使用静脉穿刺术获取的血液标本同时进行常规血培养法和LightCycler SeptiFast (SF) 实验。常规血培养法：收集20 mL血液接种到BacT/Alert FAN需氧或厌氧瓶中，并在BacT/Alert 3D自动血液培养系统(Bio-Merieux) 37 ℃培养1～5 d，当所有瓶子为阳性时，根据相应方法分离并鉴定微生物。静脉穿刺得到的5 mL含有乙二胺四乙酸(EDTA)血液同时也进行血培养法检测，其步骤根据SeptiFast Lys、SeptiFast Prep和LightCycler SeptiFast试剂盒说明书进行。PCR在LightCycler 2.0(Roche)仪器上进行。所有检测微生物通过SeptiFast识别软件识别特有的峰值，并人工计算其Tm值，当对照为阳性且无其他信号时，SF结果报告为阴性。对于某些SF检测葡萄球菌和链球菌凝固酶阴性时，可能是层流污染所致，若其临界值以及CP值高于35循环也纳入软件分析。

1.3统计学处理利用SPSS 15.0 软件进行分析。并计算灵敏度、特异度、阴性预测值。

2　结　　果

2.1两种方法细菌检出率情况在92例血液标本中，两种方法均检测阴性66例，阳性7例。4例标本血培养阳性而实时定量PCR阴性。15例标本血培养阴性而实时定量PCR阳性。实时定量PCR与血培养的阴性预测值是0.94，敏感度是0.64，特异度是0.82。在15例实时定量PCR阳性而血培养阴性的标本中，包括埃希菌属5例，肠球菌属4例，肠杆菌属3例，假单胞菌2例，金黄色葡萄球菌1例。见表1。

表1　　实时定量PCR与血培养细菌检出情况比较(n)

2.2实时定量PCR假阴性情况实时定量PCR的假阴性率为4.3%(4/92)，包括多杀性巴氏杆菌1例，解没食子酸链球菌1例，该2种病原体为包含在预先设的实时定量PCR扩增方案当中。此外，实时定量PCR也不能检测光滑念珠菌。

3　讨　论

血培养为检测血中病原微生物的经典方法，目前仍为血流感染病原微生物分离鉴定的金标准。尽管如此，血培养也存在一些由方法本身特点决定的不足，制约了其检测的速度与敏感性。首先，细菌分裂繁殖到能够检测到的水平需要一定的时间，这个速度与细菌种属有关，有些种属的细菌生长缓慢，苛养菌甚至不生长，使得血培养在细菌鉴定中速度缓慢而且敏感性差。尤其检测新生儿血流感染时敏感性更差，这是由于新生儿血培养时用于检测的血量少，而且血液中菌量低所致。其次，血培养中令人困扰的问题是进行抗生素治疗后血培养阳性率明显下降，血培养只能检测到存活的微生物，而抗生素治疗后会杀死细菌使其检出率降低。上述因素显著降低了血培养在血流感染诊断中的速度与敏感性，因此临床工作迫切要求能够快速、准确鉴定血流感染中病原微生物的敏感方法，及时、有效地控制感染，降低患者病死率。

本研究对血培养与实时定量PCR检测血流感染中的病原微生物进行了比较。先前的研究结果表明，在血液科、肿瘤科以及重症医学科等科室，实时定量PCR的敏感度范围为0.60～0.95，特异度为0.74～0.93。相比之下，本研究的敏感性相对较低，但特异性更高。本研究当中，实时定量PCR阳性，而血培养阴性标本占16.3%，而国外同类研究显示其检出率仅为10%，但Lucignano等[5]的研究却显示其检出率为36.3%。当在人体其他部位也检测出相应的病原体时，实时定量PCR阳性，而血培养阴性标本在一定程度上反映出真实的结果。然而，15例患者中5例出现阳性，但血培养阴性的标本，同样的病原体在10 d前也可检测到。然而这是否是由于使用了抗生素导致其无法生长，还是仅仅是血液中存在这些病原体的DNA，目前依然不清楚。血液中的细菌DNA与全身炎症反应综合征的发生以及脓毒血症之间是否存在关联，目前依然存在争议。有研究发现血液中游离DNA的出现是评价ICU患者发生多器官功能衰竭的危险因素，因此，实时定量PCR不但可以用于未知病原体或其DNA的检测，同时也能为临床提供有价值的信息，而这些是常规血培养难以做到的[6]。

本研究中，实时定量PCR的假阴性为4.3%，国外有报道为4.8%，但这些研究未考虑到未列入实时定量PCR扩增谱中的其他细菌。同时，对真菌的检测也是本方法存在的重要难题。实时定量PCR检测光滑念珠菌失败的原因可能是PCR反应的抑制或自我扩增效率低下，这可能与扩增该菌时选取的ITS区域过大所致[7-9]。

尽管如此，本研究也存在一些局限性。首先，由于国内外已经开展过类似的研究，因此本文的创新性也受到一定的影响；其次，纳入研究的标本数量较少(周期仅仅3个月)，因此还有必要进一步增加样本量，从而更加准确地比较实时定量PCR和血培养各自的特异性与敏感性。总之，实时定量PCR可快速、敏感地检测血流感染病原体，即便曾使用过抗生素，实时定量PCR也是一个非常有价值的检测方法[10]。然而，实时定量PCR无法获取细菌耐药方面的数据，且检测的病原体数量有限，因此它也不能完全替代常规细菌培养[11]。但两者结合，能为临床提供快速的治疗方案，最终减少耐药菌的产生而利于患者康复[12]。

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Application of real-time PCR in rapid detection of bloodstream infection pathogens

FANShizhen,LINSongqing,MoLi

(FutianDistrictHospitalofTraditionalChineseMedicine,Shenzhen,Guangdong518034,China)

ObjectiveTo investigate the clinical application value of real-time PCR in the detection of bloodstream infection pathogens.MethodsA total of 92 blood samples from 80 patients in our hospital were collected for conducting real time PCR detection and conventional blood culture.The sensitivity and specificity were compared between the two methods.ResultsAmong 92 samples,66 samples (71.7%) were negative in both assays.Ten different pathogens were detected by either blood culture system or real-time PCR or by both methods.Seven positive samples were detected by both assays.The consistence of the two methods was 79.3%.The negative predictive value of real-time PCR was 0.94,the sensitivity was 0.64 and the specificity was 0.82.Among them,15 samples were positive in real-time PCR,while negative in blood culture system,4 samples were positive in the blood culture,whereas were negative in the real-time PCR.The pathogens cultured in 2 samples were not in the detection range of real time PCR,moreover real time pCR could not detect Candida glabrata.ConclusionReal time PCR is a valuable method for rapidly detection the sample of bloodstream infection,but cannot completely replace the blood culture test.

bloodstream infection;sepsis;real-time PCR

范世珍，女，主任技师，主要从事临床医学检验工作。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.028

A

1673-4130(2016)16-2278-03

2016-03-29

2016-06-20)