超滤法去除森林脑炎灭活疫苗原液细菌内毒素的效果分析

费 刚

（长春生物制品研究所，吉林 长春 130062 ）

超滤法去除森林脑炎灭活疫苗原液细菌内毒素的效果分析

费 刚

（长春生物制品研究所，吉林 长春 130062 ）

目的 利用超滤法去除森林脑炎灭活疫苗原液细菌内毒素。方法 采用截留相对分子质量30万的超滤膜对森林脑炎灭活疫苗原液进行超滤，用动态浊度法检测超滤前后森林脑炎灭活疫苗原液中细菌内毒素含量。结果 利用超滤法去除森林脑炎灭活疫苗原液在生产过程中产生的细菌内毒素，将细菌内毒素的清除效果进行定量分析，细菌内毒素去除率可达80.0%～94.0%。结论 采用截留相对分子质量30万的超滤膜对森林脑炎灭活疫苗原液超滤中进行细菌内毒素的清除方法效果理想。

森林脑炎疫苗；细菌内毒素；超滤法；动态浊度法

森林脑炎是由森林硬蜱传染的一种疾病，疾病主要分布在我国东北地区的森林地带，由硬蜱叮咬而感染森林脑炎病毒导致患病，称森林脑炎病[1]。森林脑炎灭活疫苗可以预防森林脑炎疾病，在森林脑炎灭活疫苗生产过程中利用超滤技术可以有效去除细菌内毒素。细菌内毒素是人体在医疗诊治过程中产生发热现象的物质，极微量内毒素就能引起体温上升、休克甚至死亡[2]。2010年版《中国药典（第三部）》记载森林脑炎灭活疫苗细菌内毒素应不高于100 EU/mL（附录XIIE凝胶限度试验）[3]。动态浊度法可以定量测定细菌内毒素，测定范围在0.006～300 EU/mL。此法操作简单、快速、灵敏度高、检测范围宽，但需要精密的专用仪器[4]。本人利用超滤法去除森林脑炎灭活疫苗原液超滤前后的细菌内毒素含量的变化，定性定量地检测，系统地分析超滤技术除去细菌内毒素的效果。

1 实验材料与试药

1.1 超滤设备：①超滤器厂家 Millipore 规格/型号CUF50；②细菌内毒素检测仪（BET-16M型）（天津天大天发科技有限公司）。

1.2 森林脑炎疫苗原液：生产批号 20110605、20110806、20111009（长春生物制品研究所提供）。

1.3 试剂：①细菌内毒素工作标准品（中国生物制品检定所规格150 EU/Amp 批号2012-6）；②动态浊度法鲎试剂（ λ=0.03 EU/mL规格0.6 mL/Amp 批号0121201）；③细菌内毒素检查用水（规格5 mL/Amp 批号0120102）；④细菌内毒素指示剂（规格300 mL/Amp批号0120214）。试剂提供单位：湛江博康海洋生物有限公司。

2 方法与结果

2.1 用动态浊度法定量测定三批森林脑炎灭活疫苗原液的细菌内毒素含量，结果见表1。

表1 细菌内毒素去除效果见

2.2 将上述三批森林脑炎灭活疫苗原液的容器分别与超滤用灭菌的封闭系统相连接。 对疫苗原液进行超滤，所用膜包截留分子量为300 kD，将三批超滤液封闭待检。

2.3 用动态浊度法定量测定超滤后的三批森林脑炎灭活疫苗的细菌内毒素含量量，结果见表1。

2.4 细菌内毒素的检测

2.4.1 含量测定：细菌内毒素去除率Q=（C前-C后）/C前×100%，C前和C后分别是药液超滤前后细菌内毒素的含量 EU/mL[5]。表1中显示，三批原液经超滤后细菌内毒素大幅降低，去除细菌内毒素效率达到80%～94%，细菌内毒素浓度在7.80～29.22 EU/mL，均在药典规定细菌内毒素应不高于100 EU/mL。超滤液检定中效价测定、病毒滴定、无菌检查、支原体检查、抗原含量和蛋白含量均在要求范围之内。

2.4.2 标准曲线的绘制和试验的可靠性验证：用细菌内毒素标准品制作标准溶液系列，配制成内毒素浓度分别为2.0 EU/mL、0.5 EU/mL、0.125 EU/mL、0.03125 EU/mL的溶液。将含有0.1 mL鲎试剂溶液的每个反应管内分别加入0.1 mL的2.0 EU/mL、0.5 EU/mL、0.125 EU/mL、0.03125 EU/mL标准溶液，均匀混溶，利用检测仪检测，读取数据。各浓度标准溶液检测3份，同时作阴性对照（NC ）标准溶液2份，结果见表2。利用统计数据进行系统分析，以最小二乘方法计算，标准曲线数据为：回归方程logT=3.160-0.321logC，相关系数r=-0.9991，浓度范围0.03125 EU/mL～2.0 EU/mL。试验结果，标准溶液浓度的内毒素在2～0.03125 EU/mL时，试验反应可以控制在3600 s之内，阴性对照符合标准要求，标准曲线溶液0.03125 EU/mL也就是最小浓度反应时间为3400 s小于阴性对照时间，标准曲线试验可靠。

表2 标准曲线试验可靠性

2.4.3 干扰实验与内毒素测定：将三个批号的森林脑炎灭活疫苗超滤液分别稀释600倍，各稀释后的液体作为供试液（NPC），将0.5 EU/mL的内毒素标准品溶液，加入到各批号的供试液之中，制作阳性对照（PPC）。将各批号溶液加入0.1 mL鲎试剂溶液，定量检测细菌内毒素，各浓度要求检测2份。计算回收率：R=（CPPC-CNPC）/ λm× 100%。式中CPPC ——样品阳性对照液中细菌内毒素的含量EU/mL。CNPC——超滤后细菌内毒素的含量EU/mL。λm——标准曲线中点或一个靠近中点的细菌内毒素浓度，即0.5 EU/mL[6]。在试验过程中供试品溶液无干扰的前提是细菌内毒素回收率必须在50%～200%，此试验的回收率在114.26%～137.40%[7]。此试验表明供试液在该浓度下对鲎试剂无干扰作用，结果符合规定。

3 讨 论

采用截留相对分子质量30万的超滤膜对森林脑炎灭活疫苗原液进行超滤，去除森林脑炎灭活疫苗原液中细菌内毒素效果可靠，去除率可达到94%，有效成分的透过率在合理范围之内。超滤方法去除森林脑炎灭活疫苗原液中细菌内毒素效果是安全有效的，可以广泛应用于生产之中。

[1] 费刚.森林脑炎灭活疫苗稳定性检定[J].中国实用医药,2014,9 (3):272.

[2] 姚伟.生物制品生产中内毒素的控制及去除[C].2010.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(三部)附录XIE[M].北京:中国医药出版社,2010:附录95.

[4] 汪玲.细菌内毒素的检测方法及其应用概况[J].中国药师,2003, 6(5):316-317.

[5] 伊楠.超滤法去除中药注射液中的细菌内毒素[J].中国医药工业杂志,2008,39(12):927-929.

[6] 楼惠琴.超滤技术去除羟基喜树碱中细菌内毒素的研究[J].广州化工,2014,42(10):92-94.

[7] 胡翮.动态浊度法测定细辛注射液中细菌内毒素含量[J].中国药师,2012,15(6):891-892.

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1671-8194（2016）35-0019-02