黄腐酸作为饲料添加剂对泥鳅肠道免疫能力的影响研究

李志伟，邵士良，李戌锋，黄嘉胜，赵 波，牟 毅，储张杰，高 阳

（浙江海洋大学水产学院，浙江舟山 316022）

黄腐酸作为饲料添加剂对泥鳅肠道免疫能力的影响研究

李志伟，邵士良，李戌锋，黄嘉胜，赵 波，牟 毅，储张杰，高 阳

（浙江海洋大学水产学院，浙江舟山 316022）

在基础饲料中添加0%、0.5%、1.0%、1.5%和2%浓度梯度的矿源黄腐酸添加剂，0%作为对照组，研究黄腐酸添加剂对台湾泥鳅肠道免疫功能的影响。实验选择健康的体重（6.2±0.2）g的台湾泥鳅为试验对象，进行为期60 d的饲养实验，实验结束时对泥鳅肠道的免疫酶活性进行分析。结果显示实验组泥鳅肠道与对照组相比，溶菌酶、补体3、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、免疫球蛋白M活性明显得到提高，尤其是当添加水平达到1%时，表明饲料中添加黄腐酸能够提高泥鳅肠道免疫功能。

黄腐酸；泥鳅；肠道免疫

抗生素的使用，在一定程度上减轻了疾病的危害，但药物残留问题制约了它的使用。健康管理与生物安全已成为目前水产养殖的主要关注事项。各种非抗生素饲料添加剂如益生菌、低聚糖、植物提取物或免疫增强剂等已被广泛用于改善养殖生物的的自身免疫功能，从而提高他们对病原的抵抗力。

腐殖质是一类复杂的天然大分子芳香族聚合物，其化学组成极其复杂，主要组成元素有C、H、O、N、P，是动植物残体在微生物作用以及一系列复杂的化学作用下生成的，在土壤、腐泥、泥炭、褐煤、风化煤、动植物残体、江河湖海中均含有其组成成分[1-2]。腐殖质类物质包含四个级分：黄腐酸、棕腐酸、黑腐酸和腐黑物。黄腐酸，是腐植酸四个级分中最活跃的一个级分。黄腐酸组成中包含许多活性功能基团，包括羧基、羟基、羰基、酚基、醌类和半醌类化合物等等[3]。这些基团使黄腐酸具有许多对动物机体有益的作用，如络合重金属[4]，提高抗氧化能力、抗应激能力和免疫力[5]，以及提高抗炎症和抗病毒[6]等性能。

作为腐植酸类物质中的一员，黄腐酸在农业、畜牧业以及医药等方面，具有十分广泛的应用。农业方面，具有提高农作物抗逆性和增产的功能[7]，在畜牧业方面，腐植酸类物质能够提高养殖动物的生长率，饲料效率和免疫力，减少疾病发生的风险，提高生产效益[8-11]，在医药方面，具有杀菌消炎及镇痛作用[12]，将黄腐酸添加到养殖水体中具有净化水质的功效[13-14]，在罗非鱼及鲫鱼养殖过程中添加黄腐酸可以提高两种鱼类的生长及非特异性免疫力[15-16]。然而目前尚没有黄腐酸作为饲料添加剂在泥鳅养殖中的应用研究。因此本文通过在泥鳅基础饲料中添加适量黄腐酸，研究其对泥鳅免疫功能的影响，进而对黄腐酸的添加使用效果进行深入综合的评价。

1 材料与方法

实验所用黄腐酸为褐煤黄腐酸，来源于中国科学院化学研究所（纯度为99.3%，分子量1127，碳含量56.2%）。实验分对照组和实验组，对照组泥鳅饲料为人工配制的基础饲料，实验组饲料是在基础饲料配方中添加0%、0.5%、1.0%、1.5%和2%的黄腐酸，两组饲料均为颗粒饲料。基础饲料营养水平为鱼粉21%、豆粕36%、小麦麸皮7%、菜籽饼4%、花生油2%、玉米17%、磷酸二氢钙1.8%、维生素预混料0.12%、微量元素预混合饲料0.08%、羧甲基纤维素钠1%、麦饭10%。过饱食量喂食1 h后，将剩余的饲料取出烘干，称量，计算饲料的转化率。

泥鳅初始体重（6.2±0.1）g，选体质健壮、规格相近的泥鳅450尾，随机分配于15个20 L水箱中，用4个12 W 4孔充氧机24 h连续充气，每组设3个重复，每个水族箱放泥鳅30尾。正式试验周期为60 d，每天定时投饵（08：00、18：00），投喂量为目视饱食。整个实验过程中水温保持在24±1℃，溶氧5.0～6.0 mg/L，pH 7.1±0.2，氨氮浓度低于0.06 mg/L，亚硝酸盐浓度低于0.02mg/L，每天换水1/3。

实验结束后，停食24 h，从每个重复组随机取10尾泥鳅，用MS-222（Sigma-Aldrich）麻醉。鱼的表面用70%乙醇消毒，用手术刀切除幽门盲囊与肛门前大约1 cm之间的小肠，并用无菌钳剥离粘液和粪便，用液氮冷冻后放置在-80℃超低温冰箱中保存。分析时，取出样品化冻，以10倍的冰冻去离子水低温条件下（℃）制成匀浆后,以3000 r/min离心10 min，取上清液进行溶菌酶，补体3，免疫球蛋白M，碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的测定。酶活性的测定采用上海常斤生物科技有限公司的酶联免疫试剂盒测定。

数据分析采用SPSS16.0统计软件，对数据进行方差分析，Tukey’s检验用于各组间的比较，实验数据以“平均值±标准差”表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果分析

肠道溶菌酶活性随着黄腐酸浓度增加而增加（图1）。当黄腐酸浓度高于1.0%时，溶菌酶含量显著提高相对于对照组和0.5%添加组（P＜0.05），而对照组和0.5%添加组之间没有差异（P＞0.05）。酸性磷酸酶活性变化趋势与溶菌酶一致（图2），免疫球蛋白M含量随黄腐酸浓度增加而增加，实验组与对照组间差异显著（P＜0.05），在1.5%添加水平时达到最高，而在2.0%时又有所降低（图3）。当黄腐酸含量达到1.0%以上时，补体3含量显著高于对照组和0.5%添加组（P＜0.05），在2.0%添加水平达到最高（图4）。碱性磷酸酶活性随黄腐酸添加量增加而增加，实验组活性显著高于对照组（P＜0.05），并在2.0%添加水平达到最高（图5）。

图1 不同黄腐酸添加水平对泥鳅肠道溶菌酶活性的影响Fig.1 Effects of fulvic acid on intestinal lysozyme activities of loach

图2 不同黄腐酸添加水平对泥鳅肠道酸性磷酸酶活性的影响Fig.2 Effects of fulvic acid on intestinal acid phosphatase activities of loach

图3 不同黄腐酸添加水平对泥鳅肠道免疫球蛋白M含量的影响Fig.3 Effects of fulvic acid on intestinal IgM content of loach

图4 不同黄腐酸添加水平对泥鳅肠道补体3含量的影响Fig.4 Effects of fulvic acid on intestinal complement 3 of loach

图5 不同黄腐酸添加水平对泥鳅肠道碱性磷酸酶活性的影响Fig.5 Effects of fulvic acid on intestinal alkaline phosphatase activities of loach

3 讨论

腐植酸类物质具有特殊的结构性能和生物活性,在植物生长中起到了奇特的作用。我国在20世纪70年代曾掀起腐植酸类物质的研究和应用热潮,主要是解决当时农业生产肥料的短缺。黄腐酸结构中具有的醌基，羟基、羧基、酚羟基等多种活性基团，在动植物机体的新陈代谢及氧化还原过程起到了很重要的作用，决定了腐植酸特殊的生物活性和较高的吸附能力、缓冲、催化能力[17]。腐植酸等物质对消炎、抗病毒、调节免疫系统、抗菌、抗溃疡有明显的作用[18]。

作为一种饲料添加剂，黄腐酸已广泛应用于畜牧业生产中，用于增强动物免疫力，减少疾病发生的风险[8]。而黄腐酸在水产动物免疫方面的研究较少，在本实验中我们观察到黄腐酸添加组的泥鳅肠道溶菌酶活性和酸性磷酸酶得到显著提高，尤其是当黄腐酸添加量达到1%以上时。实验证明高浓度的腐植酸添加量，可以提高血清溶菌酶水平[19-21]，与我们所观察到的结果一致。ABDELWAHAB等[22]也证实饲料中添加腐植酸可以提高鲤鱼的生长与溶菌酶活性，最优添加量是0.8%。这与我们实验中的添加水平有一定差别，一方面可能是由于我们添加了黄腐酸，另一方面是由于鱼种的差别。溶菌酶是存在于鱼类的血清、黏液及吞噬细胞中的一种水解酶，对各种病原微生物具有重要的防御作用[23]。黄腐酸同时也显著增加了泥鳅肠道碱性磷酸酶的活性，碱性磷酸酶是动物代谢过程中重要的调控酶，作为一种非特异性磷酸水解酶，它能催化磷酸单酯的水解和磷酸基团的转移反应，对动物的生存具有重要的意义[24]。乌兰等[14]在鲫鱼饲料中添加0.3%水平黄腐酸，发现鲫鱼的碱性磷酸酶活性，溶菌酶活性都得到显著提高，酸性磷酸酶活性也略有提高但效果不明显，这与我们实验中观测到的结果基本一致。赵杰等[25]认为在中国对虾饲料中添加0.10%～0.20%生化黄腐酸，可提高对虾溶菌酶活性，增强了对虾免疫力，提高了对虾成活率。说明黄腐酸可以一定程度上提高水产动物的非特异性免疫相关酶活性。

腐植酸对动物有免疫增强作用,在免疫过程中抗原物质摄取、细胞免疫和体液免疫各阶段均有促进作用[18]。黄腐酸在腐植酸物质中生物活性最高，毒性小，研究证明黄腐酸在体液水平和细胞水平均有一定的双向免疫调节作用。常启发等[5]试验报道称，日粮中添加黄腐酸可显著提高生长猪血液中淋巴细胞数量和血清中免疫球蛋白M的含量。高金岗等[26]试验证明，黄腐酸可提高小鼠的体液免疫功能，使抗体形成增加，对细胞免疫无显著影响。薄芯等[27]指出，黄腐酸可以提高动物机体的特异性和非特异性免疫力，抵抗外来病菌的侵入，降低机体发生病变的可能性。黄腐酸可以改善动物肠道免疫功能而增强对病原菌的抵抗力如大肠杆菌[28]。NAKAGWA等[29]发现用腐植质提取物喂养香鱼可以有效的预防黄杆病毒感染。

同时，黄腐酸通过改善动物的免疫功能和代谢能力而促进各种动物的生长发育及降低应激反应。用添加黄腐酸的饲料喂养剑尾鱼，可以降低剑尾鱼的应激反应[30]。投喂腐植酸可以减轻鲤鱼因密度胁迫引起的综合症。腐植酸类物质还可以通过转录控制生物转化，抗氧化以及抗应激反应，同时修饰相关的酶活性[31-32]。

在本实验中，泥鳅肠道免疫酶活性得到明显改善，但其具体的作用机制还不清楚。我们推测黄腐酸可能诱导机体产生干扰素，增强非特异性免疫力，对病原微生物产生抗性；同时黄腐酸具有很强的吸附性和络合性，可有效吸附饲料中及消化道代谢过程所产生的各种有毒有害物质，并在肠道黏膜形成保护层而增强动物的免疫系统功能，从而减少动物肠道炎症的发生和消化疾病。鉴于黄腐酸的免疫增强作用，及其无毒害、无残留的特性，可在一定范围内代替抗生素,用作防病药剂，具有广阔的市场前景。

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Effects of Fulvic Acid on Intestinal Immunity of Juvenile Loach Paramisgurnus dabryanus(Sauvage)

LI Zhi-wei,SHAO Shi-liang,LI Xu-feng,et al
(Fishery School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

A 60-day feeding trial was conducted to determine the effect of dietary fulvic acid supplements on intestinal immune enzyme activity of juvenile loach(initial weight of 6.2±0.2 g)reared in experimental aquaria.Five test diets containing 0%,0.5%,1.0%,1.5%and 2%fulvic acid were randomly assigned to three aquaria,respectively.At the end of the experiment,lysozyme,addiment C3,immunoglobulin M,acid phosphatase activity and alkaline phosphatase activity were significantly elevated with concomitant increasing levels of dietary fulvic acid(P<0.05),especially when the additive level was above 1.0%.These results indicate that fulvic acid could improve intestinal immunity of juvenile loach.

fulvic acid;Paramisgurnus dabryanus;intestinal immunity

S963.5

A

1008－830X(2016)05－0379－05

2016-06-20

浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划项目（2015R411010）；国家级大学生创新训练项目（201510340010）；浙江海洋大学水产省一流学科开放课题（20160010）

李志伟（1994-），男，山东烟台人，研究方向：水产养殖.

高阳，研究方向：水产养殖工艺与技术.E-mail:gaoyang-82@163.com