结核感染T淋巴细胞斑点试验在结核诊断中的价值

孙虎　张莹　刘晖

【摘要】 目的：评价结核感染T淋巴细胞斑点试验对结核诊断的有效性及实用性。方法：回顾性研究2013年5月-2014年12月笔者所在医院行结核感染T淋巴细胞斑点试验患者256例，分为结核感染组和非结核感染组，计算结核感染T淋巴细胞斑点试验的一致百分率、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值，并绘制ROC曲线，计算曲线下面积。结果：结核感染T淋巴细胞斑点试验的一致百分率为93.75%，灵敏度95.88%，特异度53.85%，阳性预测值97.49%，阴性预测值41.18%，ROC曲线下面积为0.749，P=0.00。结论：结核感染T淋巴细胞斑点试验对结核感染的诊断有效性较高。

【关键词】 肺部感染； 肺结核； 结核感染T淋巴细胞斑点试验

【Abstract】 Objective：To evaluate the validity and practicability of tuberculous infection T lymphocytes spot test in the tuberculosis diagnosis.Method：256 cases of tuberculous infection T lymphocytes spot tests were retrospectively studied from May 2013 to December 2014 in our hospital.They were divided into tuberculosis infection group and non tuberculosis group.The tuberculosis consistent percentage of tuberculous infection T lymphocyte spot test，the sensitivity，specificity，positive predictive value，negative predictive value were calculated.The ROC curve was drew，the area under the curve was calculated.Result：The tuberculous infection T lymphocytes spot test consistent percentage was 93.75%，the sensitivity 95.88%，the specificity 53.85%，the positive predictive value was 97.49%，the negative predictive value was 41.18%，the area under the ROC curve was 0.749，P=0.00.Conclusion：Tuberculous infection T lymphocytes spot test validity to the diagnosis of tuberculosis infection is higher.

【Key words】 Pulmonary infection； Tuberculosis； Tuberculous infection T lymphocytes spot test

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China

肺結核在本世纪仍是严重危害人类健康的传染病，20世纪80年代中期以来结核病出现全球性恶化趋势[1-2]。鉴于全球结核病流行的大回升，对于结核早期诊断及治疗至关重要。但是传统的结核病检测方法，结核菌素试验、血沉、结核抗体均无特异性[3-4]。结核菌涂片、结核菌培养及病理虽然为肺结核诊断的金标准[5]，但是结核菌涂片阳性率低，结核菌培养时间长，病理取材受限等原因，均不利于结核的早期诊断及治疗[6]。因此需要寻找一种简单、快速、灵敏度和特异度高的检查方法是早期诊断的关键。结核感染T淋巴细胞斑点试验（T-SPOT.TB）是一种近年来分支杆菌基因组学及其细胞免疫研究成果在结核病诊断领域的成功应用[7]。通过回顾性研究2013年5月-2014年12月笔者所在医院行T-SPOT.TB的256例患者，评价其对结核诊断的有效性及实用性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2013年5月-2014年12月笔者所在医院256例行T-SPOT.TB的患者。其中女120例，男136例，平均发病年龄（56.30±18.94）岁。

1.2 入组标准

1.2.1 结核感染组 菌阳；病理明确干酪样坏死；实验性抗结核治疗1个月后随访，复查肺部CT，进行对比，影像学较前改善者。

1.2.2 非结核感染组 无结核密切接触史；经抗结核治疗临床症状及病灶影像学未明显改善。

1.3 方法

结核感染T淋巴细胞斑点试验：肝素抗凝管采集5 ml外周静脉血送新疆维吾尔自治区胸科医院检测。阳性结果为：测量孔斑点数为阴性对照的2倍以上或较阴性对照增加6个点或以上[8]。

1.4 统计学处理

应用SPSS 17.0软件进行数据处理，计量资料以（x±s）表示，分析结核感染T淋巴细胞斑点试验的一致百分率、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值，并绘制ROC曲线，计算曲线下面积，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

结核感染组243例，非结核感染组组13例，结核感染T淋巴细胞斑点试验的一致百分率为93.75%（240/256），灵敏度为95.88%（233/243），特异度为53.85%（7/13），阳性预测值为97.49%（233/239），阴性预测值为41.18%（7/17）。ROC曲线下面积为0.749，P=0.00，有统计学意义，见表1。

3 讨论

γ-干扰素释放试验的原理为，在人体感染结核杆菌时，结核分枝杆菌被巨噬细胞吞噬，产生的病原特异度蛋白的片段通过与细胞的主要组织相容性复合体相结合表达于巨噬细胞表面，然后提呈给T淋巴细胞。能够识别结核分枝杆菌抗原的T淋巴细胞分为两种，包括效应T淋巴细胞和记忆T淋巴细胞。首次感染结核分枝杆菌后产生的记忆T淋巴细胞将在人体长期存在，当再次受到结核分支杆菌相同抗原刺激后，这些记忆T淋巴细胞迅速增殖成为效应T淋巴细胞[9]。这些效应T淋巴细胞分泌γ-干扰素和其他一些细胞因子来刺激T淋巴细胞增殖并可以激活巨噬细胞，由于这个过程是针对特异结核分枝杆菌免疫原得到的反应，因此可以通过测定T细胞的γ-干扰素释放反应来检查患者是否受到结核分枝杆菌感染[9]。即利用特异蛋白刺激全血或纯化的外周血单核细胞，进而通过检测γ-干扰素的表达来判断是否有结核分支杆菌感染[10]。人们通过比较卡介苗与致病性的结核菌的基因序列后发现：一些特殊的抗原保守基因（比如RD1）在致病性的结核分枝杆菌中存在，但在结核菌进化后，因为毒力的变化，RD1逐渐丧失，故RD1基因并不存在于卡介苗及大部分非致病性的結核菌中（除堪萨斯分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、转黄分枝杆菌和海分枝杆菌）[11]，人们对RD1基因进一步研究发现：早期分泌抗原ESAT-6（early secreted antigen target-6，ESAT-6）和培养的滤过蛋白CFP-10（culture filtrate protein，CFP-10）是两个特异性抗原成分[12]，随后有大量研究表明，ESAT-6是结核病早期感染中的主要抗原，ESAT-6以及CFP-10与其他抗原相比能更强烈地被机体T细胞识别，并产生大量γ-干扰素[13]。目前国际上以此为原理的检测技术共有2种：一种是由澳大利亚Cellestis International公司研发的QuantiFERON-TB（QFT）检测技术，该检测方法通过以酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）为基础在体外检测结核特异性抗原诱导刺激的致敏T淋巴细胞所释放的γ-干扰素含量。另一种是由英国的Oxford Immunotec公司研发的T-SPOT.TB技术，它应用酶联免疫斑点技术（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）为基础，检测结核特异性抗原刺激能产生γ-干扰素的T淋巴细胞的数量，实验设有无反应性对照孔、有反应性对照孔以及抗原A和抗原B两个实验孔[9]。根据抗原A或/和抗原B孔的反应判断结果：（1）无反应性对照孔点数为0～5时，抗原A或抗原B斑点数减去无反应性对照孔斑点数后大于等于6，判读结果为阳性。（2）无反应性对照孔点数为大于等于6时，抗原A或抗原B斑点数大于等于2倍无反应性对照孔斑点数，判读结果为阳性[9]。T-SPOT.TB试验结合了ELISPOT技术与γ-干扰素释放试验，通过检测受结核分枝杆菌抗原刺激而活化的效应T细胞来诊断结核感染[14]。对活动性结核分枝杆菌感染具有较高的敏感性[15-16]。因早期分泌抗原靶6和培养滤液蛋白10均由结核分枝杆菌和牛分枝杆菌有毒菌株基因组中菌种特异性基因片断序列编码，而该序列在卡介苗和大多数非结核分支杆菌基因组中均不存在，因此，该检测不受卡介苗接种、环境分枝杆菌感染的影响，特异性强，是目前早期发现结核病最有效的检测手段[17-18]。

研究结果显示，ROC曲线下面积0.749，P=0.00，说明T-SPOT.TB对结核感染有诊断价值，T-SPOT.TB的一致百分率（93.75%）、敏感度（95.88%）及阳性预测值（97.49%）均较高，故根据以上数据可见T-SPOT.TB对结核感染的诊断有效性较高。与以往报道一致[19]。

但是结核感染T淋巴细胞特异度（53.85%）及阴性预测值（41.18%）均较低，与以往的报道存在一定的差异[20]，因此使用结核感染T淋巴细胞斑点试验对结核进行排除诊断效果不理想。10例假阴性患者中，其中有8例为老年性患者，年龄均大于60岁，7例为结核性胸膜炎患者，1例空洞型肺结核，1例粟粒性肺结核，1例浸润性肺结核。考虑引起阴性的结果与疾病的免疫功能减退等相关[21]。因此T-SPOT.TB对于胸腔积液待查的患者的诊断，还需要结合患者症状、胸水生化常规及病理进行诊断，T-SPOT.TB阴性不能盲目排除结核感染。T-SPOT.TB对于老年人群及免疫功能减退人群的诊断价值还有待进一步探究。

参考文献

[1] Nanoo A，Izu A，Ismail N A，et al.Nationwide and regional incidence of microbiologically confirmed pulmonary tuberculosis in South Afirca，2004-12：a time series analysis[J].Lancet Infect Dis，2015，15（9）：1066-1076.

[2] Nhung N V，Hoa N B，Khanh P H，et al.Tuberculosis case notification data in Viet Nam，2007 to 2012[J].Western Pac Surveill Response，2015，6（1）：7-14.

[3]王成勇，李翠萍.三种检测方法在菌阴结核病诊断中的价值[J].临床肺科杂志，2007，12（9）：933-934.

[4]高玉然，张翠英，刘琳，等.结核抗体检测及结核菌素试验在结核病诊断中的价值[J].中国热带医学，2011，11（5）：542-544.

[5]冯爽，刘树业，张立，等.噬菌体生物扩增法与常规方法在结核分枝杆菌检测中的比较[J].实用预防医学，2011，18（5）：920-922.

[6]李爱华，张国龙，沈青玉，等.不同取痰方式对新发结核病患者结核菌检出率的影响[J].国际检验医学杂志，2013，34（15）：1941-1942.

[7] Dillon D C，Alderson M R，Day C H，et al.Molecular and immunological characterization of Mycobacterium tuberculosis CFP-10，an immunodiagnostic antigen missing in Mycobacterium bovis BCG[J].J Clin Microbiol，2000，38（9）：2713-2721.

[8]谢希，陈进伟，高洁生，等.结核感染T细胞斑点试验在结核诊断中的应用[J].临床内科杂志，2010，2（6）：396-399.

[9] Pai M，Denkinger C M，Kik S V，et al.Gamma interferon release assays for detection of Mycobacterium tuberculosis infection[J].Clin Microbiol Rev，2014，27（1）：3-20.

[10] Lagrange P H，Simonney N，Herrmann J L，et al.New immunological tests in the diagnosis of tuberculosis[J].Rev MalRespir，2007，24（4）：453-472.

[11] Drobniewski F，Cobelens F，Zellweger J P，et al.Use of Gamma-interferon assays in low and medium-prevalence countries in Europe：a consensus statement of a Wolfheze Workshop organised by KNCV/EuroTB，Vilnius Sept 2006[J].Euro Surveill，2007，12（7）：E070726.2.

[12] Andersen P，Heron I.Specificity of a protective memory immune response against Mycobacterium tuberculosis[J].Infect Immun，1993，61（3）：844-851.

[13] Skjot R L，Oettinger T，Rosenkrands I，et al.Comparative evaluation of low-molecular-mass proteins from Mycobacterium tuberculosis identifies members of the ESAT-6 family as immunodominant T-cell antigens [J].Infect Immun，2000，68（1）：214-220.

[14]李林陽，陈林利，李琦.结核感染T细胞斑点试验对肺结核的临床诊断价值[EB/OL].中华肺部疾病杂志：电子版，2014，7（6）：646-650.

[15] Pai M，Zwerling A，Menzies D.Systematic review：T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection：an update[J].Ann Intern Med，2008，149（3）：177-184.

[16]孟小蓉，包勇.T-SPOT.TB在结核病合并终末期肾病透析患者中的早期诊断价值[EB/OL].中华肺部疾病杂志：电子版，2013，6（3）：277-280.

[17] Behr M A，Wilson M A，Gill W P，et al.Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray[J].Science，1999，284（5419）：1520-1523.

[18] Pai M.Alternatives to the tuberculin skin test：interferon-gammaassays in the diagnosis of mycobacterium tuberculosis infection[J].Indian J Med Microbiol，2005，23（3）：151-158.

[19]张立，孙海柏，候志丽，等.结核感染T细胞检测技术的临床应用研究[J].中华医院感染学杂志，2014，22（24）：5465-5476.

[20]李峤珂，吴雪琼，阳幼荣，等.T-SPOT.TB试剂盒在结核病临床诊断中的应用价值[J].实用医学杂志，2010，26（17）：3117-3119.

[21] Kim S H，Choi S J，Kim H B，et al.Diagnostic usefulness of a T-cel-based assay for extrapulmonary tuberculosis[J].Arch Intern Med，2007，167（20）：2255-2259.

（收稿日期：2016-09-30）