关黄柏对对乙酰氨基酚诱导大鼠急性肝损伤的保护作用

刘华，薛娟，唐振球，吴高松，王知斌，王秋红，匡海学

(黑龙江中医药大学，教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040)

中药研究

关黄柏对对乙酰氨基酚诱导大鼠急性肝损伤的保护作用

刘华，薛娟，唐振球，吴高松，王知斌，王秋红，匡海学*

(黑龙江中医药大学，教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的:研究关黄柏对对乙酰氨基酚(APAP)诱导的大鼠急性肝损伤的保护作用。方法:采用对乙酰氨基酚所致大鼠急性肝损伤模型，给药24 h后检测大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP);留取肝脏组织，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜观察肝脏组织病理变化;制备肝匀浆，测定肝中还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量。结果:与空白组比较，模型组小鼠血清中ALT、AST和ALP活性明显升高，肝脏组织出现明显的肝细胞变性坏死;与模型组相比，不同浓度的关黄柏可以明显降低小鼠血清中ALT、AST和ALP的活性，降低肝组织中MDA的含量，升高GSH的含量，肝组织病理损伤也明显减轻。结论:关黄柏对对乙酰氨基酚致小鼠急性肝损伤具有明显的保护作用。

关黄柏;对乙酰氨基酚;急性肝损伤

关黄柏为芸香科植物黄檗的干燥树皮。性苦、寒，归肾、膀胱经。具有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮功效。用于湿热泻痢，黄疽尿赤，带下阴痒等［1］，具有抗菌、抗真菌、镇咳、抗肝炎、抗溃疡以及免疫抑制等药理作用［2-3］。对于对乙酰氨基酚造成肝损伤，普遍认为原因是由于其在生物转化过程中产生了大量的氧自由基等毒性代谢产物，与细胞膜结合产生脂质过氧化反应产生大量脂质过氧化产物，肝细胞抗氧化能力下降，进而产生氧化应激损伤［4］。本研究主要是通过对乙酰氨基酚导致的急性肝损伤模型来研究关黄柏对对乙酰氨基酚引起的急性肝损伤的保护作用，为找到对乙酰氨基酚肝损伤的临床解毒剂提供依据。

1 材料与动物处理

1.1 实验药品

所选用的关黄柏购买于哈尔滨世一堂药店，经黑龙江中医药大学药用植物学教研室苏连杰教授鉴定为芸香科植物黄檗的干燥根皮。

1.2 实验试剂及仪器

考马斯亮蓝染料G250(Amesco);双蒸水(本实验室采用MilliQ纯水仪制备);MDA、GSH、ALT、AST、ALP试剂盒(南京建成生物工程研究所);菜卡2135型切片机(德国);Moticam3000显微摄影成像系统(美国);电热恒温箱(上海);罗氏cobas c311全自动生化分析仪(瑞士);Thermo Scientific Evolution 260 Bio紫外分光光度仪(美国);HITACHI高速离心机(日本)。

1.3 中药水煎液的制备

按临床常用方法对药物进行处理。称取定量的上述药材，加入10倍量水，浸泡60 min，快速加热至沸腾，煎煮60 min，倾出药液，残渣再加入8倍水，煎煮提取60 min。合并2次药液，滤过，黄柏浓缩至含生药量为1 g/mL的中药水提液，4℃储存备用。

2 实验方法

2.1 实验动物分组及给药

雌性SD大鼠36只，体质量(180±20)g，购自黑龙江中医药大学医学实验动物中心，置于动物饲养笼中，保持室内温度18～22℃，室内昼夜自然明暗交替照明，饲养标准大鼠饲料。将大鼠随机分为6组，分别为:空白对照组、联苯双脂阳性药组(0.3 g/kg)、模型组、关黄柏高剂量组(280 mg/kg)、中剂量组(140 mg/kg)、低剂量组(70 mg/kg)，每组6只。大鼠在鼠笼里适应7天后，空白组给予生理盐水，连续灌胃(每 100 g体质量1 ml)15天最后1次给药30 min后，除正常对照组其余各组均皮下注射对乙酰氨基酚(450 mg/kg)制备大鼠急性肝损伤模型。各组饲养过程中保持温度、光照、湿度等环境条件均衡，自由进食饮水。

2.2 样品制备

各给药组连续诱导15天后，实验取材前一天晚8点大鼠禁食不禁水，次日上午SD大鼠腹腔内注射1%戊巴比妥钠麻醉(每100 g体质量0.15 ml)，迅速打开腹腔，腹腔采血，从门静脉注射冰冷的生理盐水，清除残留血液，取出肝脏，用冰冷缓冲液洗净，去除肝脏表面的血液，用滤纸吸干表面液体，切成0.5～1.0 cm3大小，用10%中性福尔马林固定，以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部，常规石蜡制片，HE染色，光镜观察。

2.3 生化指标检测

取分离好的血清，采用罗氏Cobas c311全自动生化分析仪上测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)。

2.4 检测肝脏中GSH和MDA的含量

按照实验方法学上组织匀浆的制备:称取一定量的肝脏组织，按照肝脏组织重量(g):体积(mL)=1∶9的比例加入9倍体积0.9%的生理盐水，在冰上进行研磨，制备成10%的匀浆液，3 000 r/min，离心10 min，取上清液进行测定。取10%的匀浆液500 μL根据试剂盒法对谷胱甘肽(GSH)含量进行测定。在420 nm的吸光度进行测定，单位为mg/g。取10%的匀浆液100 μL，采用TBA(硫代巴比妥酸)在532 nm处测定MDA的含量，单位为μmol/g。GSH和MDA及蛋白质含量测定严格按照试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

3 实验结果

3.1 生化指标

关黄柏对对乙酰氨基酚致大鼠血清ALP、ALT和AST中的影响结果见图1(A-C)。肝脏是最大的解毒器官，ALT主要存在于肝脏、心脏和骨骼肌中，AST作为重要的转氨酶之一，临床上是肝功能检查的指标，主要用来判断肝脏是否受到损伤。主要分布在心、肝、肾和骨骼肌中。ALT和AST是肝内的主要功能酶，在肝细胞或者组织损伤及坏死时，肝细胞膜通透性增加，转氨酶从细胞内溢入血液，使得血清相关转氨酶的水平显著升高。ALP是一组催化磷酸单酯水解的酶类，分布范围比较广，主要存在肝脏、骨骼、肾脏等组织中，是从肝脏经胆汁排泄的一种酶。中药导致肝毒性时，使胆汁排泄受到抑制，造成血清ALP升高。临床上ALT、ALP和AST是肝毒性的重要指标。我们的实验结果表明，与正常对照组相比较，模型组血清ALT、AST和ALP均显著升高，具有显著差异(P＜0.01)。不同浓度黄柏及阳性药可以显著降低模型组的大鼠血清转氨酶，具有极显著差异(P＜0.01)。其中高浓度关黄柏作用最强，表现出较好的保肝效果。

表1 各组ALT、AST、ALP水平比较(±s，n=6)

表1 各组ALT、AST、ALP水平比较(±s，n=6)

注:与空白组相比，*P＜0.01;与模型组相比，＊＊P＜0.01。

组别ALT AST ALP正常组18.96±4.96 58.23±8.12 43.13±6.11模型组 62.06±9.54*84.12±10.07*79.12±9.04*阳性药组 28.57±6.32＊＊60.42±7.16＊＊59.67±7.29＊＊低剂量组 30.09±7.12＊＊60.72±7.25＊＊48.87±6.11＊＊中剂量组 27.45±5.12＊＊48.97±5.21＊＊44.34±5.38＊＊高剂量组 20.62±4.11＊＊48.17±6.09＊＊39.92±6.20＊＊

3.2 对大鼠肝组织还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的影响

关黄柏对对乙酰氨基酚致大鼠肝组织GSH和MDA的影响结果见图2。GSH是机体内主要的抗氧化剂和自由基清除剂，主要的功能是清除自由基、抗衰老、抗氧化。具体机制是与自由基、重金属等结合，使机体内有毒的物质转化为无毒的物质，排出体外，同时对抗自由基对脏器组织的损害，保护肝细胞［5］。实验研究表明，与空白组比较，模型组GSH含量降低，具有显著差异(P＜0.01)。与模型组比较，不同浓度的关黄柏组可以显著地提高 GSH水平，具有显著差异(P＜0.01)，说明关黄柏能保护肝细胞免受氧化应激损伤。关黄柏可通过升高肝脏GSH水平有效的减轻或消除对氨基酚肝脏毒性、改善肝细胞坏死程度。

图1 血清ALP(A)，ALT(B)和AST(C)在各实验组大鼠的活性(n=6)

在生物体内，MDA是自由基氧化的最终产物之一，MDA增多能加剧膜的损伤，可引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性。因此在肝损伤中MDA含量是一个常用指标，可通过MDA含量了解过氧化的程度［6-8］，以间接测定损伤程度。实验研究表明，与空白组比较，模型组MDA含量升高，具有显著差异(P＜0.01)。与模型组比较，黄柏能显著地降低MDA水平，具有显著差异(P＜0.01)。其中关黄柏组与空白组比较MDA降低，有显著性差异(P＜ 0.01)，GSH水平升高，具有显著差异(P＜0.01)。

表2 各组GSH、MDA水平比较(±s，n=6)

表2 各组GSH、MDA水平比较(±s，n=6)

注:与空白组相比，*P＜0.01;与模型组相比，＊＊P＜0.01。

组别GSH MDA正常组6.38±1.01 2.01±0.41模型组 3.73±0.50*4.41±0.86*阳性药组 6.35±1.16＊＊2.24±0.62＊＊低剂量组 6.44±1.05＊＊2.52±0.67＊＊中剂量组 6.53±1.03＊＊2.34±0.77＊＊高剂量组 6.97±1.24＊＊2.26±0.62＊＊

图2 肝组织中GSH，MDA在各实验组大鼠的活性(n=6)

3.3 肝组织细胞的病理学变化

光镜下观察空白组肝细胞排列整齐，没有出现脂肪样变性，肝小叶结构完整，没有发生病理改变(图3-A)。模型组肝细胞间间隙有大量炎症细胞，肝组织可见局部点状、片状水肿变(图3-B)。阳性药及不同浓度的关黄柏可改善对对氨基酚引起的大鼠肝组织细胞形态变化，阳性药及低、中、高浓度的关黄柏对肝脏病理损害改善较为明显(图3C～F)。

图3 不同组别的HE染色病理切片图(×400)

4 讨论

对乙酰氨基酚是建立肝损伤的常用模型药物，而血清学指标ALT，AST，ALP是反应肝实质损害的常见的主要酶学指标，所以本实验选用对乙酰氨基酚作为造模药物，用ALT，AST，ALP作为判断肝损伤的程度［9］。从本实验结果可以看出，模型组小鼠血清的3个酶学指标均显著增高，表明小鼠肝脏受到损害，肝损伤模型是成功的。而给予不同浓度的关黄柏小鼠的酶学指标均显著降低，并且呈现一定的剂量依赖关系。经过检测肝功能指标和病理结果表明，关黄柏具有明显的减毒效果，随着浓度增加，效果更加明显肝脏是最大的解毒器官，体内的代谢及去除毒素都在肝脏中完成，因而肝脏易受多种有害因素攻击。肝损伤主要是由于细胞膜的氧化损伤或生物转化异常导致［10］，对乙酰氨基酚具有抑制肝脏中的GST，升高MDA的活性，说明其毒性作用的产生与抗氧化酶相关。关黄柏对对乙酰氨基酚造成的肝损伤具有保护作用，能减轻肝细胞坏死，防止纤维化和脂肪变性，同时可以提高肝脏内GSH和降低MDA活性，能保护对氨基酚引起的肝细胞膜脂质过氧化损伤，提高肝细胞存活率，增强机体抗氧化作用。

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Protective Effect of Phellodendri Amurensis Cortex on Acetaminophen-induced Acute Hepatic Injury in Rats

LIU Hua，XUE Juan，TANG Zhen-qiu，WU Gao song，WANG Zhi-bin，WANG Qiu-hong，KUANG Hai-xue*
(Key Laboratory of Chinese Materia Medica(Ministry of Education)，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)

Objective:To investigate the protective effect of Phellodendri Amurensis Cortex on acetaminopheninduced acute hepatic injury in rats.Methods:Liver injury models were induced by subcutaneous injection of acetaminophen.Twenty-four hours later，the activities of serum alanine aminotransferase(ALT)，aspartate aminotransferase(AST)and alkaline phosphatase(ALP)were determined，and the liver tissues were collected for histopathological assessment by HE staining under light microscope.The contents of glutathione(GSH) and malondialdehyde(MDA)in liver homogenate were also measured.Results:Compared with the normal control group，the model group could markedly increase serum ALT，AST and ALP activities，and the degeneration and necrosis could be observed in liver tissues.Compared with the model group，Phellodendri Amurensis Cortex could markedly decrease serum ALT，AST and ALP activities，reduce the MDA level in liver homogenate，and increase the content of GSH in the liver homogenate.The hepatic histopathological changes in liver were also significantly ameliorated.Conclusion:The Phellodendri Amurensis Cortex can prevent the liverfrom acetaminophen-induced acute hepatic injury.

Phellodendri Amurensis Cortex;Acetaminophen;Acute hepatic injury

R285.6

A

1002-2406(2017)02-0001-04

国家重点基础研究发展计划(973)项目(No.2013CB531801);国家自然科学基金面上项目(No.81473351)

刘华(1990-)，男，硕士研究生，主要从事中药药效物质基础研究工作。

匡海学*(1955-)，男，教授，博士研究生导师，主要从事中药性味理论和中药药效物质基础研究工作。

2016-07-19

修回日期:2016-08-01