针刺配合黄连温胆汤加减对代谢综合征大鼠胰岛素抵抗及脂肪细胞因子的影响

马育轩，于国强，*，张洪财，隋艳波，崔健昆，宣威，陈洪琳

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

针刺研究

针刺配合黄连温胆汤加减对代谢综合征大鼠胰岛素抵抗及脂肪细胞因子的影响

马育轩1，于国强1，2*，张洪财1，隋艳波2，崔健昆2，宣威2，陈洪琳2

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的:通过针灸配合中药汤剂黄连温胆汤干预MS大鼠，观察针刺配合黄连温胆汤加减对膳食诱导MS大鼠胰岛素抵抗及脂肪细胞因子、Leptin、下丘脑Leptin受体和NPY蛋白表达的影响，探讨相关作用机制。方法:以高脂高糖高盐饲料喂养建立MS大鼠模型，选择符合标准的MS大鼠随机分为模型对照组、针刺组、黄连温胆汤组、针刺加黄连温胆汤组。针刺及给药后4周检测大鼠空腹血糖、血清TC、TG、血清胰岛素、瘦素、血脂、丘脑Leptin受体与神经肽Y(NPY)，计算胰岛素敏感性指数和Lee's肥胖指数。结果:针刺组、黄连温胆汤组、针刺加黄连温胆汤组大鼠体质量、Lee's肥胖指数、血压、空腹血糖(FBG)、血清胰岛素(FINS)、HOMA-IR、TG、TC较模型组水平均下降(P＜0.05);针刺加黄连温胆汤组大鼠脂肪细胞因子蛋白表达较单纯针刺组和黄连温胆汤组Leptin、Leptin-R下降程度更大，NPY升高程度更大(P＜0.05)。结论:通过针刺结合黄连温胆汤的治疗方案，可以通过调控JAK-STAT途径中Leptin、Leptin-R及NPY的表达改善脂类代谢的表达，从而有效抑制胰岛素抵抗，起到对MS的治疗作用。

MS;胰岛素抵抗;针刺;黄连温胆汤;脂肪因子

代谢综合征(Metabolic Syndrome，MS)即以肥胖、高血压、糖代谢异常及脂代谢异常等一组代谢紊乱证候群［1-2］。其共同病理生理基础为胰岛素抵抗(Insulin Resistance，IR)，IR的发生与多种因素有关，如年龄、饮食、妊娠、肥胖、种族、遗传等，其中肥胖以中心型肥胖为主。近年来研究［3］发现，脂肪组织远非一个能量储存器，而是一个复杂的、重要的、功能高度活跃的内分泌器官，其分泌的瘦素、TNF-α的信号，可分别和内分泌神经中枢、胰岛及肌细胞进行脂脑、脂胰、脂肌及脂肝的对话，形成复杂的反馈网络，调节神经肽Y (NPY)、下丘垂体、肾上腺轴及性腺轴功能，调节胰岛素分泌、肌细胞胰岛素受体敏感性，以及GLUT4的表达、转位等以维持糖脂代谢。本实验拟用针刺配合黄连温胆汤加减干预治疗膳食诱导型MS大鼠，观察其对IR和脂肪细胞因子瘦素(Leptin)、及下丘脑Leptin受体与神经肽Y(NPY)蛋白表达的影响，探讨相关作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料及试剂

SD大鼠(黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供，动物合格证号:黑动字第P00102008);胆固醇(北京中山生物工程有限公司，批号20130202);Leptin放免分析药盒(武汉博士德生物工程有限公司);血脂试剂盒(中国大连宝生物工程有限公司);Leptin受体与神经肽Y(NPY)试剂盒(中国上海捷瑞生物工程有限公司，批号20131201)。

1.2 仪器设备

动物多通道无创血压测定仪(瑞士Mettler公司);微量血糖仪及配套血糖试纸(德国Eppendorf公司);全自动生化仪(美国Beehman公司);γ放射免疫计数器(型号 FJ-2008PS，国营 262厂);电子天平(0.000 1 g，中国上海精密仪器仪表公司)。

1.3 造模方法

将健康雄性SD大鼠60只随机分为空白组10只，给予普通饲料(骨粉3%，鱼粉5%，玉米粉30%，面粉20%，麸子20%，豆饼20%，食盐2%);实验组50只，给予高脂高糖高盐饲料(基础饲料53%，猪油15%，蔗糖15%，蛋黄10%，食盐5%，胆固醇2%);饲喂20周。检测体质量、血压;用血清生化法检测空腹血糖、血清胰岛素、血脂、C肽，筛选MS成模大鼠。

1.4 成模情况

空白组大鼠无死亡，实验组大鼠死亡6只，存活率90%。选择在具备肥胖成模标准［4］基础上符合甘油三酯水平升高、高密度脂蛋白水平降低、高血压及胰岛素敏感指数升高4项标准中任意2项者作为MS大鼠模型复制成功标准。

1.5 动物分组

空白组(A)大鼠10只。筛选MS模型成功大鼠36只，编号后依次登记，由随机数字表法产生36个随机数字，采用简单随机化分组方法，随机分为模型对照组(B)9只、针刺组(C)9只、黄连温胆汤组(D)9只、针刺加黄连温胆汤组(E)9只。

1.6 针刺及给药

针刺组腧穴选择参照华兴邦教授方法［5］，选择大鼠“合谷”“曲池”“后三里”“三阴交”等腧穴针刺;黄连温胆汤组选择黄连温胆汤加减配伍方剂:黄连、半夏、陈皮、茯苓、葛根、决明子、甘草、竹茹、黄芪、丹参等，给药剂量为6.7 g/(kg·d);针刺加黄连温胆汤组按针刺组方法针刺，同时按黄连温胆汤组方法给药;空白组和模型组等量蒸馏水灌胃，空白组给予普通饲料，其他各组继续给予高糖高脂高盐饲料。4周后取材。

1.7 标本采集

处死前禁食12 h，乙醚麻醉后，腹主动脉取血，静置后离心取上清，-20℃保存待测，随即取肾周、附睾、肠系膜脂肪垫(内脏脂肪)，用电子天平称重，并立即将附睾脂肪垫放入液氮中，-80℃保存待测。

1.8 实验指标检测

电子天平测定体质量，大鼠血压仪测定尾动脉收缩压;微量血糖仪及配套试纸测定各组大鼠空腹血糖(FPG);全自动生化分析仪检测各组大鼠血清TC、TG;放免法检测血清胰岛素、瘦素(Leptin，LP)，全自动生化仪测定血脂，用免疫组化方法进行检测下丘脑Leptin受体与神经肽Y(NPY)蛋白表达。计算胰岛素敏感性指数［3］:HOMA-IR=(FPG×FINS)/22.5;计算Lee's肥胖指数。

1.9 统计学处理

SPSS13.0统计软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 针刺配合黄连温胆汤加减对MS大鼠体质量、血压、糖脂代谢及胰岛素抵抗的影响

模型组大鼠体质量、Lee's肥胖指数，血压、空腹血糖(FBG)、血清胰岛素(FINS)、HOMA-IR、TG、TC较空白组均明显增高(P＜0.05);针刺组、黄连温胆汤组、针刺加黄连温胆汤组大鼠体质量、Lee's肥胖指数，血压、空腹血糖(FBG)、血清胰岛素(FINS)、HOMAIR、TG、TC较空白组均明显增高(P＜0.05)，较模型组水平均下降(P＜0.05);针刺加黄连温胆汤组大鼠体质量、Lee's肥胖指数，血压、空腹血糖(FBG)、血清胰岛素(FINS)、HOMA-IR、TG、TC较单纯针刺组和黄连温胆汤组下降程度更大(P＜0.05)。见表1。

表1 针刺配合黄连温胆汤加减对MS大鼠体质量、血压、糖脂代谢及胰岛素抵抗的影响(±s)

表1 针刺配合黄连温胆汤加减对MS大鼠体质量、血压、糖脂代谢及胰岛素抵抗的影响(±s)

注:与空白组(A)比较，*P＜0.05;与针刺加黄连温胆汤组(E)比较，△P＜0.05。

组别 n 体质量(g) 收缩压(mmHg) FBG(mmol/L) FINS(mU/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) Lee's肥胖指数HOMA-IR A 10 430.95±0.64 110.22±2.11 4.51±0.54 21.21±4.21 0.94±0.21 2.68±0.31 335.44±31.00 4.36±1.36 B 9 523.12±54.21*136.22±2.33*6.11±0.21*32.11±5.21*1.19±0.14*3.28±0.28*361.43±17.22*8.92±1.08*C 9 491.21±37.11△132.21±9.33△5.42±0.51△30.21±5.21△1.08±0.21△2.88±0.22△356.21±10.11△7.08±0.68△D 9 482.22±32.21△135.24±3.44△5.39±0.14△39.21±4.14△1.07±0.17△2.87±0.21△350.78±10.94△6.67±1.93△E 9 342.11±12.22 120.27±8.21 5.21±0.21 27.35±4.34 0.96±0.12 2.77±0.32 342.88±12.07 6.16±0.94

2.2 针刺配合黄连温胆汤加减对MS大鼠脂肪细胞因子瘦素(Leptin，LP)、Leptin受体(Leptin-R)及神经肽Y(NPY)蛋白表达的影响

模型组大鼠脂肪细胞因子蛋白表达较空白组Leptin、Leptin-R均明显增高，NPY明显降低(P＜0.05);针刺组、黄连温胆汤组、针刺加黄连温胆汤组大鼠脂肪细胞因子蛋白表达较空白组Leptin、Leptin-R均明显增高，NPY明显降低(P＜0.05)，较模型组Leptin、Leptin-R均降低，NPY升高(P＜0.05);针刺加黄连温胆汤组大鼠脂肪细胞因子蛋白表达较单纯针刺组和黄连温胆汤组Leptin、Leptin-R下降程度更大，NPY升高程度更大(P＜0.05)。见表2，图1。

表2 针刺配合黄连温胆汤加减对MS大鼠脂肪细胞因子瘦素(Leptin，LP)、Leptin受体(Leptin-R)及神经肽Y(NPY)蛋白表达的影响(±s)

表2 针刺配合黄连温胆汤加减对MS大鼠脂肪细胞因子瘦素(Leptin，LP)、Leptin受体(Leptin-R)及神经肽Y(NPY)蛋白表达的影响(±s)

注:与空白组(A)比较，*P＜0.05;与针刺加黄连温胆汤组(E)比较，△P＜0.05。

组别n Leptin Leptin-R NPY A 10 3.40±0.28 19.33±2.29 51.52±2.53 B 9 6.81±1.20*39.63±3.62*25.13±1.25*C 9 5.90±1.54△34.21±2.17△27.21±2.81△D 9 5.41±0.67△32.21±3.21△29.27±2.41△E 9 4.66±1.03 26.21±2.12 39.21±2.85

图1 针刺配合黄连温胆汤加减对MS大鼠脂肪细胞因子瘦素(Leptin，LP)、Leptin受体(Leptin-R)及神经肽Y(NPY)蛋白表达的影响

3 讨论

黑龙江省位于亚欧大陆东部的中高纬度，冬季风来自高纬内陆，受极地大陆气团控制，严寒干燥，寒潮频繁，冬季漫长。由于特殊的气候特点，本地人喜高脂高盐饮食，随之带来的是肥胖、高血压、高血脂等一系列亚健康状态，并由此引发MS、心脑血管疾病等。

肥胖及脂代谢紊乱均属于中医学“痰湿”范畴，中医学在治疗代谢综合症这一方面是运用中草药，相对于西药治疗，中医从脏腑辨证分析，认为MS主要与肝、脾、肾三脏的功能有关，重在调理，讲究辨证，而且副作用小［6-11］。另一方面，通过针灸相应穴位，并通过针灸来调理内分泌，使之趋于正常。《灵枢·逆顺肥瘦》曰:“此肥人也。广肩腋，项肉薄，厚皮而黑色，唇临临然，其血黑以浊，其气涩以迟”，说明了肥胖者的形态及气血特点［12］。古人对肥胖有一定的认识，但这种认识尚不深刻，这可能也与生活条件不够发达、肥胖者较少肥胖程度较轻有一定关系。当今社会，肥胖成为全球的流行病。随着相关疾病(如MS)发病率的不断升高，人们越来越清醒的认识到肥胖的危害。身体质量控制的实质是饮食与运动调控，但这是多数肥胖者不愿接受的。于是，采用针刺结合中医汤药的方案成为一种切实有效且副作用小的治疗MS方法，是医学工作者研究的一个重点。张翠彦等［13］以超声测量内脏脂肪厚度(VFT)作为主要评价指标，采用针刺结合饮食控制、运动方案治疗单纯性向心性肥胖取得确切疗效;韩海荣等［14］针刺“足三里”“三阴交”“中脘”等穴位，不仅能够降低肥胖大鼠下丘脑NPY和瘦素(Leptin)基因表达，并引起其血清含量的下降，而且能提高Leptin受体基因表达，从而增强Leptin信号传导，抑制机体食欲，进而控制摄入量，减少脂肪蓄积，达到减肥目的。

近几年来关于MS发病机理及防治的研究较为深入的是obese基因(ob基因)，其蛋白产物称为Leptin，是潜在可用于MS治疗的靶基因［15］。

Leptin主要由脂肪细胞分泌，胰岛素和肾上腺糖皮质激素促进Leptin的分泌，再进入到血中。Leptin能跨越血脑屏障。Leptin的作用分为周围和中枢作用，其中枢作用主要在下丘脑通过受体介导。Leptin-R长亚型受体是广泛地分布在脑内，Leptin-R短亚型受体是分布在周围组织。脑内Leptin-R主要分布在脉络丛、下丘脑、弓状核。Leptin与弓状核Leptin-R相互作用，给大脑带来了体内燃料储存的信息。Leptin是一个有力的抑胃因素，有饱食因子的作用，可减少摄食，增加能量的消耗，增加产热，至少防止能量消耗降低，增加胰岛素的敏感性。给由于基因变性后，既不生产，又不分泌Leptin的ob/ob鼠服用Leptin，它们的摄食、体质量、大多数代谢异常恢复正常［16］。在遗传性肥胖的大多数肥胖的人中，循环中Leptin水平升高。这是由于高胰岛素血症和高肾上腺皮质类固醇血症诱导了Leptin分泌。Leptin降低血中胰岛素水平，降低脂肪组织的储存能力，增加葡萄糖的利用，Leptin引起的改变有利于氧化消耗储存的脂肪。中枢功能障碍时，阻碍正常Leptin进入脑的特殊区域并发挥作用，不充足的中枢信号可导致胰岛素抵抗。当小鼠有Leptin-R无突变，缺乏Leptin-R时，脑内的Leptin浓度降低，在下丘脑上调开胃神经肽，小调诱导引饱食的神经肽，可使动物的摄食增加，产热降低，能量的消耗减少，产生肥胖、IR和 Leptin抵抗。提高脑内的Leptin浓度，增加胰岛素敏感性。给予胰岛素预处理后，Leptin引起的反应是显著地减少。

JAK-STAT途径则可能是Leptin受体后信号转导通路中目前已知的一个最主要的途径［17］。Leptin-Leptin受体(尤其是 OBRb)-STAT3(磷酸化)-NPY-胰岛素通路参与了Leptin和胰岛素抵抗的中枢信号转导过程，在MS的发生、发展过程中发挥了重要的作用。

Leptin的中枢作用通过NPY介导，Leptin降低下丘脑Leptin的浓度，或小调NPY的表达，进而降低摄食。在脑内的有关代谢、食欲、IR等信号分子相互作用，Leptin处于NPY的上游。脑内给予Leptin增加腰部交感神经的兴奋性，升高评价动脉压血压。给正常大鼠脑室内灌注Leptin，能降低NPY水平，Leptin和NPY一同保持人体的能量平衡［18］。

本课题拟采用针刺配合黄连温胆汤的方法干预MS大鼠，检测其对MS大鼠胰岛素抵抗及脂肪细胞因子、Leptin、下丘脑Leptin受体NPY蛋白表达的影响，对中医学传统干预手段进行优化组合，遴选出最佳治疗方案，并探讨相关作用机制，观察OBRb-STAT3(磷酸化)-NPY-胰岛素通路在肥胖的发生、发展过程中发挥了重要的作用及其对脂类代谢的调控作用。结果发现，针刺加黄连温胆汤组大鼠体质量、Lee's肥胖指数，血压、空腹血糖(FBG)、血清胰岛素(FINS)、HOMA-IR、TG、TC较单纯针刺组和黄连温胆汤组下降程度更大(P＜0.05);针刺加黄连温胆汤组大鼠脂肪细胞因子蛋白表达较单纯针刺组和黄连温胆汤组Leptin、Leptin-R下降程度更大，NPY升高程度更大(P＜0.05)。说明通过针刺结合黄连温胆汤的治疗方案，可以通过调控JAK-STAT途径中Leptin、Leptin-R及NPY的表达改善脂类代谢的表达，从而有效抑制胰岛素抵抗，起到对MS的治疗作用。

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R285.5

A

1002-2406(2017)02-0071-04

国家自然科学基金面上项目(No.81273650);国家自然科学基金青年基金项目(No.81503495);黑龙江中医药大学校科研基金资助面上项目(No.201501)

马育轩(1983-)，男，助理研究员，博士，黑龙江中医药大学中药学博士后流动站工作人员，主要研究方向:方剂药效物质基础及作用机理研究。

于国强*(1982-)，男，副主任医师，黑龙江中医药大学中西医结合学科博士后科研流动站在站人员，主要研究方向:针刺镇痛及腧穴特异性研究。

2016-10-17

修回日期:2016-11-10