虫生广布拟盘多毛孢侵染对松突圆蚧海藻糖酶活性、海藻糖、葡萄糖和蛋白质含量的影响

王莎莎 何锦华 罗世念 彭锋 罗林 黄宝灵 吕成群

摘要：【目的】探究蟲生广布拟盘多毛孢对松突圆蚧营养物质代谢的影响，为深入研究广布拟盘多毛孢致死松突圆蚧机理及开发利用广布拟盘多毛孢防治松突圆蚧提供科学依据。【方法】以虫生广布拟盘多毛孢GXSTYJ03菌株制得浓度为1×107个孢子/mL的孢子悬浮液感染松突圆蚧，以喷洒无菌吐温-80为对照，逐日测定松突圆蚧体内海藻糖、葡萄糖、蛋白质含量及海藻糖酶活性，连续测定8 d。【结果】处理组松突圆蚧海藻糖含量在各时间点均低于对照组，且随处理时间延长呈明显的下降趋势，在染菌3 d后显著低于对照组（P<0.05，下同）；海藻糖酶活性在各时间点均高于对照组，在染菌后第3 d显著高于对照组，5 d后也一直显著高于对照组；葡萄糖含量在染菌后1～3 d迅速升高，第3 d时升至最大值（3.1479 mmol/L），随后逐渐降低，在第4～6 d时与对照组无显著差异（P>0.05），6 d后显著低于对照组；蛋白质含量在各时间点均低于对照组，且在染菌2 d后一直显著或极显著（P<0.01）低于对照组。【结论】虫生广布拟盘多毛孢GXSTYJ03菌株侵染松突圆蚧过程中引起松突圆蚧体内海藻糖、葡萄糖和蛋白质含量一定程度降低，是致死松突圆蚧的原因之一。

关键词： 虫生广布拟盘多毛孢；松突圆蚧；海藻糖；葡萄糖；海藻糖酶；蛋白质

中图分类号： S763.306.4 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）05-0820-05

Influence of Entomogenous Pestalotiopsis disseminata on trehalase activity， trehalose content， glucose content and

protein content in Hemiberlesia pitysophila Takagi

WANG Sha-sha1， HE Jin-hua2， LUO Shi-nian2， PENG Feng 2， LUO Lin 3，

HUANG Bao-ling 1， LYU Cheng-qun1 *

（1 College of Forestry， Guangxi University， Nanning 530004， China； 2 Yulin Forest Pest Control Quarantine Station， Yulin， Guangxi 537000， China； 3 Yuzhou Forest Pest Control Quarantine Station， Yulin， Guangxi 537000， China）

Abstract：【Objective】Influence of Entomogenous Pestalotiopsis disseminata on nutrients metabolism of Hemiberlesia pitysophila Takagi was studied， in order to provide reference for mechanism of Entomogenous P. disseminata causing H. pitysophila Takagi dead and using Entomogenous P. disseminata to control H. pitysophila Takagi. 【Method】Entomogenous P. disseminata GXSTYJ03 strain was utilized to make the spore suspension of 1×107 spores/mL and infected H. pitysophila Takagi. Spraying sterile Tween was taken as control（CK） Contents of trehalose， glucose， protein and trehalase activity in H. pitysophila Takagi were detected for eight consecutive days. 【Result】At all measurement times， trehalose content of treatment group were lower than that of CK group， as treatment time extended， trehalose content of treatment group declined and was significantly lower than that of CK group 3 d after infection（P<0.05， the same below）. At all measurement times， trehalase activity of treatment group were higher than that of CK group， and was significantly higher on day 3 of infection and 5 d after infection. Glucose content increased rapidly 1-3 d after infection and reached the peak（3.1479 mmol/L） on day 3， then declined gradually， and the difference with CK group was insignificant on 4-6 d（P>0.05）， and significantly lower than that of CK group after 6 d. Protein content of treatment group was lower than that of CK group at all measurement times， and was at significant or extremely significant level（P<0.01） 2 d after infection. 【Conclusion】When Entomogenous P. disseminata GXSTYJ03 strain infecting H. pitysophila Takagi， trehalose， glucose and protein content decrease sharply， which is one of the lethal reasons.

Key words： Entomogenous Pestalotiopsis disseminata； Hemiberlesia pitysophila Takagi； trehalose； glucose； trehalase； protein

0 引言

【研究意义】松突圆蚧（Hemiberlesia pitysophila Takagi）又名松栉盾蚧，属同翅目（Homoptera）蚧总科（Cocoidea）盾蚧科（Diaspidae）突圆蚧属（Hemiberlesia Cockerell）昆虫，是严重危害松属植物的害虫（Takagi，1969；Takagi and Tang，1982）。近年来，利用虫生广布拟盘多毛孢（Entomogenous pestalotiopsis disseminata）制成生防菌剂防治松突圆蚧取得了理想的效果（方丽英等，2007；黄宝灵等，2009；Lü et al.，2011），但部分地区松突圆蚧危害范围仍以一定速度继续扩增。因此，深入研究虫生广布拟盘多毛孢对松突圆蚧的致病机制，能为开发具有强效、持久、安全防治松突圆蚧的广布拟盘多毛孢菌株提供科学依据，促使该项生物防治技术的推广应用。【前人研究进展】方丽英等（2007）从自然死亡的松突圆蚧死尸上分离得到虫生广布拟盘多毛孢并将其制成生防菌防治松突圆蚧，发现以生防菌防治松突圆蚧的效果显著，其致死率远高于松突圆蚧自然死亡率。但在生防菌制备过程中无法避免虫生真菌退化现象，菌株的退化会严重影响防治效果，因此郭丽娟等（2014）对虫生广布拟盘多毛孢GXSTYJ03菌株的退化原因进行研究，明确了影响该菌株退化的主要因素及菌株复壮的最佳方法，为大批量生产菌粉剂提供了技术保障。黄蓉等（2014）、吕成群等（2014）探讨虫生广布拟盘多毛孢GXSTYJ03侵染对松突圆蚧胞外酶作用及对松突圆蚧酚氧化酶原系统的影响，掌握了该菌株的生物学特性，分析了影响虫生广布擬盘多毛孢对松突圆蚧致病的毒力因子，明确菌株孢子悬浮液1×107个孢子/mL是酶制剂生产和病虫害防治的最佳使用量，以及松突圆蚧对虫生广布拟盘多毛孢侵染的免疫反应。然而昆虫的免疫反应是一个复杂体系，会调度多种抵抗因子来防御病原真菌入侵，这个过程会消耗大量营养物质，主要表现为海藻糖、葡萄糖和蛋白质含量发生变化。薛皎亮等（2006）对油松毛虫感染白僵菌后体内蛋白质变化情况进行研究，发现感染白僵菌1～8 d后虫体内的蛋白质含量持续下降。熊琦（2013）研究发现，桃小幼虫在受到球孢白僵菌TST05菌株侵染后，其体内的海藻糖和蛋白质含量明显下降，葡萄糖含量呈先升高后下降趋势。昆虫体内的营养物质主要以海藻糖形式存储，海藻糖存在于昆虫几乎所有组织和器官中，利用唯一能将海藻糖分解为葡萄糖的海藻糖酶来供给能量（于彩虹等，2008）。病原真菌菌丝一旦进入昆虫血腔，便利用昆虫体内的物质作为营养以保证菌丝的生长和大量繁殖，逐渐感染昆虫内部组织和器官，最终使昆虫感染死亡。感染导致寄主昆虫死亡的因素是多方面的，其中，病菌在虫体内大量繁殖，耗尽虫体的营养物质是导致昆虫死亡的一个重要因素（樊金华等，2013）。【本研究切入点】关于虫生广布拟盘多毛孢GXSTYJ03菌株的生产及防治松突圆蚧等方面的研究已较完善，但有关虫生广布拟盘多毛孢的致病机制仅见其侵染可抑制松突圆蚧的酚氧化酶原系统功能，从而克服松突圆蚧免疫反应的报道。目前，关于虫生广布拟盘多毛孢对松突圆蚧体内营养物质代谢影响的研究尚无文献报道。【拟解决的关键问题】逐日测定感染虫生广布拟盘多毛孢GXSTYJ03菌株的松突圆蚧体内海藻糖、葡萄糖、蛋白质含量及海藻糖酶活性，了解虫生广布拟盘多毛孢对松突圆蚧营养物质代谢的影响，为广布拟盘多毛孢致死松突圆蚧机理研究及开发利用广布拟盘多毛孢防治松突圆蚧提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试虫生广布拟盘多毛孢GXSTYJ03菌株由广西大学林学院黄宝灵研究员提供；供试松突圆蚧采自玉林市玉州区林场马尾松林。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 松突圆蚧染菌 参照吕成群等（2014）的方法染菌。先制备GXSTYJ03菌株的1×107个孢子/mL孢子悬浮液，然后用装有孢子悬浮液的手动喷雾器将菌液喷于带有松突圆蚧的松针针叶，保证针叶基部叶鞘部分被菌液喷湿。以喷洒无菌吐温-80且带有松突圆蚧的松针为对照组。在20 ℃、湿度95%、14 h/10 h光暗交替条件下室内培养。

1. 2. 2 松突圆蚧海藻糖、葡萄糖、蛋白质含量及海藻糖酶活性测定 处理后1～8 d逐日在对照组和处理组中随机取样，每组取100只松突圆蚧作为一个样品，每组3个样品作为重复。用预冷的1.5 mL 0.2 mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.0）冰浴碾磨虫体，并将匀浆液最终定容至2.0 mL，4800 r/min离心10～15 min，取上清液待测。

1. 2. 2. 1 海藻糖含量测定 采用蒽酮法（冯慧，1989）测定海藻糖含量。

标准曲线制作：先配制海藻糖标准溶液100 mL，浓度为40 mmol/L[称取海藻糖（Sigma）1.5132 g，以蒸馏水定容]，-70 ℃储存。用蒸馏水稀释得7个浓度梯度，分别为0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80和1.60 mmol/L。取上述溶液100 μL移入10 mL离心管中，加入100 μL 1%硫酸溶液，在90 ℃条件下加热10 min，冰浴冷却，再加入100 μL 30%氢氧化钾溶液，并再次加热10 min，冰浴冷却后加入2.5 mL显色剂[250 mL 80%的硫酸溶液+0.5 g蒽酮（Sigma）]，加热10 min后冰浴冷却，立即于630 nm处读取OD。

海藻糖含量测定：以待测提取液100 μL代替标准溶液，按上述方法进行测定。

1. 2. 2. 2 海藻糖酶活性测定 采用3，5-二硝基水杨酸法（雷芳等，2006）测定海藻糖酶活性，并略有改进。

葡萄糖标准曲线制作：先配制葡萄糖标准溶液200 mL，浓度为20 mmol/L（称取葡萄糖0.79268 g，以蒸馏水定容），-70 ℃储存。用蒸馏水稀释，得浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mmol/L的葡萄糖溶液。分别取上述溶液300 μL移入10 mL离心管中，加入300 μL显色剂[0.5 g 3，5-二硝基水杨酸（Sigma）+0.1 g苯酚+

0.5 g氢氧化钠+0.025 g无水亚硫酸钠，蒸馏水定容至50 mL]于90 ℃条件下加热5 min，冰浴冷却，再加入100 μL 40%四水合酒石酸碱钠水溶液，立即于550 nm处读取OD。

海藻糖酶活性测定：用移液枪吸取待测提取液100 μL于10 mL离心管中，加入200 μL海藻糖标准溶液（40 mmol/L），于37 ℃条件下水浴30 min，然后沸水浴2～3 min终止反应，冰浴冷却后加入上述显色剂，并按照上述方法测定葡萄糖含量。该葡萄糖为海藻糖酶催化分解海藻糖所形成的葡萄糖。海藻糖酶活性以mmol/L（葡萄糖）·mg（蛋白）·min表示。

1. 2. 2. 3 葡萄糖含量测定 按试剂盒（南京建成生物工程研究所）操作方法进行。

1. 2. 2. 4 蛋白质含量测定 以牛血清蛋白（BSA，Sigma）为标准蛋白，采用考马斯亮蓝G-250染色法（Bradford，1976）进行测定。松突圆蚧蛋白质含量单位为mg/100只。

2 结果与分析

2. 1 不同处理对松突圆蚧海藻糖含量的影响

处理后逐日取样测定松突圆蚧体内海藻糖含量，结果如图1。由图1可知，对照组松突圆蚧体内的海藻糖含量无较大波动，在0.6924～0.7286 mmol/L小幅度变化；而处理组各时间点所测海藻糖含量均小于对照组，且随处理时间延长呈明显的下降趋势，在染菌后1～3 d海藻糖含量急速下降，第4 d略有升高但相较第3 d无显著差异（P>0.05，下同），随后缓慢下降，并在第7 d达最低点，为0.1702 mmol/L，与对照组相比降低了76.53%，两者间差异达极显著水平（P<0.01，下同）。

2. 2 不同处理对松突圆蚧海藻糖酶活性的影响

处理后逐日取样测定松突圆蚧体内海藻糖酶活性，结果如图2。由图2可知，松突圆蚧体内的海藻糖酶活性变化趋势与海藻糖含量变化趋势相反，染菌后海藻糖酶活性逐渐升高，在染菌后3 d海藻糖酶活性（1.6570 mmol/L·min·mg）显著高于对照组（P<0.05，下同）；染菌后4 d有所降低，但与对照组差异不显著；随后又开始上升，并在第7 d时达最高点（1.7173 mmol/L·min·mg），显著高于对照组，而在第6和8 d时与对照组相比达极显著差异水平。

2. 3 不同处理对松突圆蚧葡萄糖含量的影响

对松突圆蚧体内葡萄糖含量的测定结果（图3）显示，对照组虫体内的葡萄糖含量在试验期内无明显变化，维持在1.6741～1.8606 mmol/L；而处理组松突圆蚧体内的葡萄糖含量变化明显，在感染初期葡萄糖含量上升，在染菌后3 d迅速升高至3.1479 mmol/L，是对照组的1.92倍，且差异达极显著水平，随后开始下降，在4～6 d时与对照组无显著差异，7 d后处理组葡萄糖含量显着低于对照组。

2. 4 不同处理对松突圆蚧蛋白质含量的影响

由图4可看出，处理组松突圆蚧体内的蛋白质含量在试验期内均低于对照组，在第7 d时降到最低值0.2581 mg/100只，只有对照组的51.41%，且处理后2～5 d和第7 d时蛋白质含量与对照组相比差异达极显著水平。

3 讨论

昆虫细胞内海藻糖含量较高时能保护细胞活性，增强昆虫生存和防御伤害的能力，在抵御冲击负荷等方面有重要作用（雷芳等，2006；陆玉建等，2015）。病原真菌在侵染寄主過程中，菌丝生长所需能量主要来源于寄主。本研究结果显示，松突圆蚧被真菌侵染3 d后，其体内海藻酶活性迅速升高，且一直高于对照组，反之海藻糖含量迅速降低且一直低于对照组；随着海藻糖被海藻糖酶降解，在第1～3 d时葡萄糖含量显著升高，为真菌菌丝生长和繁殖提供了能量，在染菌3 d后葡萄糖含量开始下降，且在5 d后明显低于对照组，说明病菌突破了昆虫的抵御防线，使得昆虫疾病加重逐渐进入死亡阶段。菌丝除了直接消耗寄主体内的葡萄糖外，也有可能利用自身的海藻糖酶分解寄主体内的海藻糖，从而促使寄主提高海藻糖酶活性来分解海藻糖获取能量，因此导致处理组的海藻糖酶活性始终高于对照组，海藻糖含量则低于对照组，该变化对松突圆蚧的取食行为和免疫能力有极大影响，与樊金华等（2013）研究感染布氏白僵菌后油松毛虫血淋巴中海藻糖酶活性、海藻糖和葡萄糖含量的变化结果相似。

随着真菌菌丝在寄主体内生长和大量繁殖，寄主体内海藻糖和葡萄糖被大量消耗，虫体为了维持自身的生理活动，极有可能分解蛋白质。菌丝在侵染虫体时也会释放蛋白酶（黄蓉等，2014）分解寄主蛋白质从而贯穿于虫体各组织，因此本研究处理组幼虫的蛋白质含量在染菌2 d后即显著低于对照组。总之，正是由于病原真菌侵染虫体导致虫体内海藻糖酶活性增强将海藻糖转化为葡萄糖，这一过程既为真菌提供了营养而有利于病原真菌生长和提高感染力，同时又破坏虫体内血糖平衡，从而加速昆虫死亡。

据报道，某些真菌具有海藻糖酶，其分为酸性海藻糖酶和中性海藻糖酶，本研究中虫生广布拟盘多毛孢GXSTYJ03菌株在侵染松突圆蚧时是否利用海藻糖酶及是何种海藻糖酶在起作用有待进一步探究；同时，虫生广布拟盘多毛孢对松突圆蚧体内保护酶和解毒酶等相关防御酶系的影响亦有待后续研究。

4 结论

本研究结果表明，虫生广布拟盘多毛孢侵染松突圆蚧过程中引起虫体内海藻糖、葡萄糖和蛋白质含量一定程度降低，导致其无法供给维持自身生命活动所需的能量，是致死松突圆蚧的原因之一。

参考文献：

樊金华，谢映平，薛皎亮，张海涛. 2013. 感染布氏白僵菌后油松毛蟲血淋巴中海藻糖酶活性、海藻糖和葡萄糖含量的变化[J]. 昆虫学报，56（8）：864-869. [Fan J H，Xie Y P，Xue J L，Zhang H T. 2013. Changes of trehalase activity and contents of trehalose and glucose in the hemolymph of Dendrolimus tabulaeformis（Lepidoptera：Lasiocampidae） larvae infected with Beauveria brongniartii[J]. Acta Entomologica Sinica，56（8）：864-869.]

方丽英，黄宝灵，王缉健，李贵玉，李瑞龙，吕成群. 2007. 松突圆蚧生防菌的毒力试验[J].中国森林病虫，26（6）： 25-27. [Fang L Y，Huang B L，Wang J J，Li G Y，Li R L，Lü C Q. 2007. Toxicity experiment of biocontrol fungus isolated from emiberlesia pitysophila[J]. Forest Pest and Disease，26（6）：25-27.]

冯慧. 1989. 昆虫生物化学分析法[M]. 北京：农业出版社：9-10. [Feng H. 1989. Biochemical Analysis Method for Insect[M]. Beijing：Agriculture Press：9-10.]

郭丽娟，黄宝灵，吕成群，黄蓉，李瑞龙，何锦华，何钰，卢强，黄艳红，任涵. 2014. 不同环境条件对虫生广布拟盘多毛孢退化的影响[J]. 广西林业科学，43（2）：147-150. [Guo L J，Huang B L，Lü C Q，Huang R，Li R L，He J H，He Y，Lu Q，Huang Y H，Ren H. 2014. Effect of different environmental factors on degeneration of Entomogenous Pestalotiopsis disseminate[J]. Guangxi Forestry Science，43（2）：147-150.]

黄宝灵，丁波，方丽英，宋力，陈炳雄，李健荣，王清. 2009. 松突圆蚧生防菌粉剂的林间扩散能力[J]. 中国生物防治，25（S1）：24-28. [Huang B L， Ding B， Fang L Y，Song L，Chen B X，Li J R，Wang Q. 2009. The diffusion ability of biocontrol fungi pulvis of Hemiberlesia pitysophila Takagi in forest[J]. Chinese Journal of Biological Control，25（S1）：24-28.]

黄蓉，吕成群，黄宝灵，郭丽娟，姚姜铭，李瑞龙，何锦华，何钰，卢强. 2014. 虫生广布拟盘多毛孢蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶产生水平及其毒力关系研究[J]. 南方农业学报，45（7）：1172-1177. [Huang R，Lü C Q，Huang B L，Guo L J，Yao J M，Li R L，He J H，He Y，Lu Q. 2014. Relationships between virulence and activities of protease， chitinase and lipase produced by entomogenous Pestalotiopsis disseminate[J]. Journal of Southern Agriculture，45（7）：1172-1177.]

雷芳，张桂芬，万方浩，马俊. 2006. 寄主转换对B型烟粉虱和温室粉虱海藻糖含量和海藻糖酶活性的影响[J]. 中国农业科学，39（7）：1387-1394. [Lei F，Zhang G F，Wan F H，Ma J. 2006. Effects of plant species switching on contents and dynamics of trehalose and trehalase activity of Bemisia tabaci B-biotype and Trialeurodes vaporariorum[J]. Scientia Agricultrua Scinca，39（7）：1387-1394.]

陆玉建，张韩杰，刘南南. 2015. 大肠杆菌otsA基因的克隆和转化本生烟草[J]. 江苏农业学报，31（1）：32-38. [Lu Y J，Zhang H J，Liu N N. 2015. Cloning of otsA gene in Escherichia coli and its transformation into Nicotiana benthamiana[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，31（1）：32-38.]

吕成群，黄宝灵，任涵，李文禄，黄蓉，郭丽娟. 2014. 虫生广布拟盘多毛孢GH10菌株对松突圆蚧的致病力测定[J]. 南方农业学报，45（6）：980-983. [Lü C Q，Huang B L，Ren H，Li W L，Huang R，Guo L J. 2014. Virulence of Pestalotiopsis disseminata GH10 strain to Hemiberlesia pitysophila[J]. Journal of Southern Agricultrue，45（6）：980-983.]

熊琦. 2013. 桃小食心虫病原真菌——球孢白僵菌TST05菌株的研究[D]. 太原：山西大学. [Xiong Q. 2013. Study on Beauveria bassiana strain TST05-An entomopathogenic fungus for Carposina sasakii[D]. Taiyuan： Shanxi University.]

薛皎亮，牛宇，谢映平. 2006. 油松毛虫感染白僵菌后体内蛋白质、酯酶和多酚氧化酶的变化[J]. 应用与环境生物学报，12（6）：814-818. [Xue J L，Niu Y，Xie Y P. 2006. Changes of protein，esterase and PPO in Dentrolinus tabulaefomis infected by Beauveria bassiana[J]. Chinese Journal of Applied & Environmental Biology，12（6）：814-818.]

于彩虹，卢丹，林荣华，王晓军，姜辉. 2008. 海藻糖——昆虫的血糖[J]. 昆虫知识，45（5）：832-836. [Yu C H， Lu D， Lin R H， Wang X J， Jiang H. 2008. Trehalose—The blood sugar in insects[J]. Chinese Bulletin of Entomology，45（5）：832-836.]

Bradford M M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein using the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry， 72： 248-254.

Lü C Q，Huang B L，Qiao M J，Wei J G，Ding B. 2011. Entomopathogenic fungi on Hemiberlesia pitysophila[J]. PLoS one，6（8）：1-6.

Takagi S. 1969. A new species of Chionaspis from Florida（Homoptera：Coccoidea）[J]. Kontyu，37（3）：269-271.

Takagi S，Tang F T. 1982. A new scale insect of the Quernaspis group（Homoptera， Coccoidea，Diaspididae） from China[J]. Kontyu，50（1）：100-103.

（責任编辑 麻小燕）