正交试验优化滇重楼核苷提取工艺

杨敏 郭冬琴 沈昱翔 潘兴娇 张杰 张静 李昌玲 周浓

摘要：【目的】優化滇重楼核苷的提取工艺条件，为滇重楼资源的开发和利用提供技术支持。【方法】以滇重楼根茎为试验材料，6种核苷类物质（胞苷、尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷和2'-脱氧腺苷）总提取量为考察指标，采用高效液相色谱法测定其提取量，先分析超声波提取法和热水浸提法对滇重楼核苷提取效果的影响，然后在单因素试验的基础上，以甲醇体积分数、料液比、提取时间和提取次数为考察因素，采用L9（34）正交试验对滇重楼核苷类物质提取工艺进行优化，确定最佳工艺条件。【结果】超声波提取法得到的滇重楼根茎中6种核苷类物质总提取量高于热水浸提法；4个因素对滇重楼核苷总提取量的影响排序为甲醇体积分数>提取时间>提取次数>料液比，最佳提取工艺条件为：以纯净水（甲醇体积分数为0）为提取溶剂，在料液比1∶10（g/mL）、30 ℃条件下超声波提取60 min，提取2次，得到滇重楼根茎中胞苷、尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷和2'-脱氧腺苷的总提取量为1.4216±0.0198 mg/g，高于理论值1.3434 mg/g。【结论】正交试验优化得到的滇重楼核苷超声波提取工艺操作简便、稳定可靠，较热水浸透法的提取效率高，适合用于滇重楼核苷的提取。

关键词： 滇重楼；核苷；正交试验；提取工艺；优化

中图分类号： R284.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）05-0876-07

Optimization of extraction of nucleosides from Paris polyphylla var. yunnanensis by orthogonal test

YANG Min1， GUO Dong-qin2， SHEN Yu-xiang 3， PAN Xing-jiao1， ZHANG Jie2，

ZHANG Jing 2， LI Chang-ling 2， ZHOU Nong 1，2*

（1 College of Pharmacy and Chemistry， Dali University， Dali， Yunnan 671000， China； 2 College of Life Science and Engineering， Chongqing Three Gorges University， Chongqing 404000， China； 3 College of Agriculture，

Anshun University， Anshun， Guizhou 561000， China）

Abstract：【Objective】The technical conditions of extracting nucleosides from Paris polyphylla var. yunnanensis were optimized， which provided technical support for the exploitation and utilization of P. polyphylla var. yunnanensis. 【Method】With rhizome of P. polyphylla var. yunnanensis as experimental material and total extracted amount of six nucleosides（cytidine，uridine，guanosine，thymidine，adenosine and 2'-deoxyadenosine） as examining indexes，high performance liquid chromatography（HPLC） method was adopted to determine the extraction amount. First， the effects of ultrasonic extraction and hot water extraction on the extracted amount of nucleosides from P. polyphylla var. yunnanensis were analyzed， then based on single factor experiments， methanol volume fraction， material liquid ratio， extraction time and extraction frequency were selected as experimental factors. Extraction of nucleosides from P. polyphylla var. yunnanensis was optimized by using L9（34） orthogonal experiment to select the optimal technical conditions. 【Result】The total extracted amount of six nucleosides by ultrasonic extraction was higher than that by hot water extraction. The effects of four experimental factors on total extracted amount of six nucleosides from P. polyphylla var. yunnanensis were ranked as follows： methanol volume fraction>extraction time>extraction frequency>material-liquid ratio. The optimal extraction conditions were as follows： pure water（methanol volume fraction was 0） was used as extraction solvent， material-liquid ratio 1∶10（g/mL）， extraction time 60 min at 30 ℃ and extracting twice. Under these conditions， the total extracted amount of cytidine， uridine， guanosine， thymidine， adenosine and 2'-deoxyadenosine in rhizome of P. polyphylla var. yunnanensis was 1.4216±0.0198 mg/g， which was higher than theoretical value 1.3434 mg/g. 【Conclusion】The ultrasonic extraction method optimized by orthogonal test is simple and reliable， the extraction rate of ultrasonic extraction is higher than hot water extraction. It is suitable for the extraction of nucleosides from P. polyphylla var. yunnanensis.

Key words： Paris polyphylla var. yunnanensis； nucleoside； orthogonal test； extraction process； optimization

0 引言

【研究意义】滇重楼为百合科植物云南重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）的干燥根茎，为常用清热解毒、消肿止痛药之一（国家药典委员会，2015），临床上常用于治疗出血、肿瘤和炎症性疾病等（赵保胜等，2011；王岚等，2014）。目前已从滇重楼根茎中分离出甾体皂苷、核苷类、黄酮类、多糖类、氨基酸类等活性成分（赵保胜等，2011；周浓等，2016），其中核苷类具有抗肿瘤、抗血小板聚集、抗缺血性损伤、调节免疫功能及抗病毒等多种生物活性（Lee et al.，2003；张雪梅等，2012），广泛应用于功能性食品和药品等方面（刘洋等，2012；房舒舒等，2016），说明滇重楼核苷在医药保健产业中具有一定的应用潜力。因此，如何有效地提取滇重楼根茎中的核苷类物质，对开发利用滇重楼具有重要意义。【前人研究进展】目前，有关重楼有效成分提取的研究主要集中在皂苷、多糖和黄酮类，其中皂苷的提取方法有超声波提取（蒋雪等，2006；李维莉等，2010；刘江等，2016）、加热回流提取（孙治国等，2007）和微波提取（喻祖文等，2013）等，超声波提取工艺通常采取正交试验，选取溶剂体积分数、提取时间、料液比、提取次数、提取温度等因素进行优化考察。关于多糖提取，刘芸等（2014）采用Box-Behnken响应面法对陕西产重楼中多糖的超声提取工艺进行优化，在温度72 ℃、超声功率330 W、时间25 min、液料比14∶1（mL/g）的优化条件下，得到重楼中多糖的平均提取率为3.87%；周浓等（2014a）对滇重楼多糖的回流提取、热水浸提和超声波辅助提取3种提取工艺进行对比研究，结果表明，3种提取方法对滇重楼多糖提取率影响差异不显著，但超声波辅助提取较热水浸提和回流提取具有能耗低的优点；之后又对滇重楼总黄酮的提取工艺进行研究，得到最佳提取工艺：以甲醇为提取溶剂，回流提取2次，每次2 h，料液比1∶60（g/mL）（周浓等，2014b）。此外，本课题组（潘兴娇等，2016；周浓等，2016）在前期研究中利用超声波辅助提取滇重楼中水溶性成分，采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定滇重楼根茎中水溶性成分含量，结果发现其水溶性成分主要是核苷类物质，尤其以胞苷、尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷和2'-脱氧腺苷含量较高。【本研究切入点】目前有关重楼核苷类成分的提取工艺研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以滇重楼根茎为原料，选取甲醇体积分数、料液比、提取时间和提取次数为考察因素，采用L9（34）正交试验优化滇重楼核苷类物质的提取工艺条件，以期为滇重楼资源的深加工及其在医药保健方面的开发利用提供技术参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

滇重楼药材采自云南省丽江市石鼓镇栽培基地，经重庆三峡学院生命科学与工程学院郭冬琴副教授鑒定为百合科植物云南重楼的干燥根茎，洗净后35 ℃下干燥至恒重，粉碎过50目筛，密闭贮藏备用。尿苷、胸苷和腺苷对照品购自中国食品药品检定研究院，批号分别为110887-200202、101215-201401和110879- 200202，胞苷、鸟苷和2'-脱氧腺苷对照品购自南京都莱生物技术有限公司，纯度经HPLC峰面积归一化法计算，均大于98%；甲醇色谱纯购自德国默克公司，试验用水为娃哈哈牌纯净水。

主要仪器设备：LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津制作所）；SB-5200DTN型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司，超声波功率300 W，工作频率40 kHz）；TDZ5-WS型多管架自动平衡离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司）；CP225D型分析天平（德国赛多利斯集团）。

1. 2 6种核苷类物质的HPLC测定

参照潘兴娇等（2016）的方法进行胞苷、尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷和2'-脱氧腺苷HPLC测定。色谱柱：Venusil MP C18（2）柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A相为甲醇，B相为水，进行梯度洗脱（0～10 min，1% A～5% A；10～15 min，5% A～15% A；15～22 min，15% A～17% A；22～26 min，17% A～20% A；26～30 min，20% A～22.5% A）；检测波长260 nm；体积流量1.0 mL/min；进样量20 μL；柱温35 ℃。

1. 3 提取方式选择

在目前有关核苷和碱基提取方法的文献中，多采用超声波提取法（Duan et al.，2011；周浓等，2016）和热水浸提法（陈家念等，2014），故本研究主要考察这两种方法对滇重楼根茎中核苷类提取量的影响，以获得最佳的提取效率。

1. 3. 1 超声波提取滇重楼中核苷类物质 精密称取滇重楼粉末20.0 g，置于500 mL具塞锥形瓶中，加入400 mL蒸馏水，混匀，30 ℃条件下超声波提取15 min，取出后放至室温，摇匀，分批次取50 mL提取液倒入离心管中，4000 r/min离心10 min，混合后用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

1. 3. 2 热水浸提滇重楼中核苷类物质 精密称取滇重楼粉末20.0 g，置于500 mL具塞锥形瓶中，加入400 mL蒸馏水，混匀，85 ℃水浴浸提24 h，取出后放至室温，摇匀，分批次取50 mL提取液倒入离心管中，4000 r/min离心10 min，混合后用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

1. 4 单因素试验

精密称取滇重楼粉末20.0 g，置于500 mL具塞锥形瓶中，利用超声波提取法（超声波功率300 W，提取温度30 ℃），选取甲醇体积分数（0、15%、30%、50%、70%和100%）、提取时间（15、30、60和90 min）、料液比（1∶10、1∶20、1∶40和1∶60 g/mL）、提取次数（1、2、3和4次）4个因素进行试验，研究这4个因素对滇重楼6种核苷类物质总提取量的影响。分别在1.3项色谱条件下进样，进行峰面积测定，根据c样品/c对照品=A样品/A对照品，计算滇重楼根茎中6种核苷类物质的总提取量。

1. 5 正交试验优化提取工艺

根据单因素试验结果，选择对滇重楼根茎中核苷类物质总提取量有意义的因素水平，采用L9（34）正交试验优化滇重楼核苷提取工艺条件。正交试验因素与水平见表1。

1. 6 统计分析

采用SPSS 22.0对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 样品的液相色谱测定结果

由图1可知，在1.2色谱条件下，均能在30 min内较好地分离出胞苷、尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷和2'-脱氧腺苷，与相邻化学成分峰能够达到基线分离，分离度均大于1.52，且峰形良好。

2. 2 提取方式的选择结果

由于采用超声波提取法提取滇重楼根茎中6种核苷类物质得到的总含量（1.0274±0.0131 mg/g）明显高于热水浸提法（0.6689±0.0437 mg/g），故选择超声波提取法进行后续试验。

2. 3 单因素试验结果

2. 3. 1 甲醇体积分数对滇重楼核苷提取量的影响 在料液比1∶20、提取时间30 min、超声波提取1次的条件下，考察不同甲醇体积分数对滇重楼核苷提取量的影响。由图2可知，滇重楼根茎中6种核苷类物质在不同甲醇体积分数条件下的提取效果存在差异。胞苷提取量随甲醇体积分数的增加呈先降低后升高再降低的变化趋势，其中在0～30%和50%～100%范围内呈降低趋势，在30%～50%范围内呈升高趋势，各甲醇体积分数的胞苷提取量间存在显著差异（P<0.05，下同）；尿苷提取量在甲醇体积分数为0时最高，随着甲醇体积分数的增加，呈直线下降趋势；鸟苷和腺苷提取量在甲醇体积分数为0的条件下也最高，但随着甲醇体积分数的增加呈先降低后略有升高再降低的变化趋势；胸苷提取量随甲醇体积分数的增加呈降低趋势，但变化不明显；2'-脱氧腺苷提取量在甲醇体积分数为30%时达最大值，显著高于其他甲醇体积分数。从6种核苷类物质的总提取量来看，随着甲醇体积分数的增加，总提取量逐渐降低，在甲醇体积分数为0（纯水）时最高，故本研究选择纯净水作为滇重楼核苷类物质的提取溶剂。

2. 3. 2 提取时间对滇重楼核苷提取量的影响 以纯净水为提取溶剂，在料液比1∶20、超声波提取1次的条件下，考察不同提取时间对滇重楼核苷提取量的影响。由图3可知，提取时间在90 min内，样品溶液中胞苷和尿苷提取量随提取时间的延长呈逐渐降低趋势，但递减速率小，表明这两种核苷对提取时间不敏感；鸟苷提取量随提取时间的延长呈先升后降再升的变化趋势，提取时间为30 min时提取量达最大值，显著高于其他提取时间；胸苷提取量随提取时间的延长呈逐渐升高趋势，但60 min后趋于平缓；腺苷提取量随提取时间的延长呈先升高后降低趋势，提取时间为30 min时提取量达最大值；2'-脱氧腺苷提取量随提取时间的延长呈先降低后升高再略有降低的变化趋势。从6种核苷类物质总量来看，其提取量随提取时间的延长呈先升高后降低再略有升高的变化趋势，30 min的提取量最高，之后显著下降，因此最佳提取时间为30 min。

2. 3. 3 料液比对滇重楼核苷提取量的影响 以纯净水为提取溶剂，在提取时间30 min、超声波提取1次的条件下，考察不同料液比对滇重楼核苷提取量的影响。从图4可看出，胞苷和胸苷提取量随料液比的减小呈先升高后降低的变化趋势，在料液比为1∶20时提取量达最大值，显著高于其他料液比的提取量；在料液比为1∶10～1∶20的范围内，尿苷和腺苷提取量快速升高，超过1∶20后呈快速降低趋势；鸟苷提取量在料液比为1∶10～1∶60的范围内变化不明显；2'-脱氧腺苷提取量随料液比的减小呈逐渐升高趋势，超过1∶40后趋于平缓。从滇重楼6种核苷类物质总提取量来看，其在料液比1∶10～1∶20的范围内快速升高，1∶20时达最大值，之后呈显著下降趋势，因此，选择1∶20为最佳料液比。

2. 3. 4 提取次数对滇重楼核苷提取量的影响 以纯净水为提取溶剂，在料液比1∶20、提取时间30 min的条件下，考察不同提取次数对滇重楼核苷提取量的影响。从图5可看出，对滇重楼核苷进行第1次超声波提取，6种核苷类物质总提取量达0.8715 mg/g，占4次提取总量的87.89%，提取出大部分核苷类物质，虽然随着提取次数的增加，提取量仍有升高，但考虑到增加提取次数将极大增加成本投入，故认为核苷提取1次即可。

2. 4 滇重楼核苷提取工艺条件的优化结果

综合单因素试验结果，考察甲醇体积分数（A）、提取时间（B）、料液比（C）和提取次数（D）对胞苷、尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷和2'-脱氧腺苷6种核苷类物质总提取量的影响。由表2可知，极差R排序为RA>RB>RD>RC，即甲醇体积分数对6种核苷类物质总提取量影响最大，其次是提取时间和提取次数，料液比影响最小。根据极差分析得到滇重楼根茎中核苷提取的最佳工艺條件为A1B3C1D2，即以纯净水为提取溶剂，在料液比1∶10、30 ℃条件下超声波提取60 min，提取2次，总提取量理论值为1.3434 mg/g；而根据直观分析得到滇重楼根茎中核苷提取的最佳工艺条件为A1B3C3D3，即以纯净水为提取溶剂，在料液比1∶40、30 ℃条件下超声波提取60 min，提取3次，得到6种核苷类物质总提取量为1.3082 mg/g。极差分析结果与直观分析结果不同，故需进行最佳工艺条件的验证试验。

2. 5 最佳工艺条件的验证结果

精密称取滇重楼粉末20.0 g，置于500 mL具塞锥形瓶中，以最佳工艺条件提取，按1.3色谱条件进行测定，设3次平行。滇重楼根茎中胞苷、尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷和2'-脱氧腺苷6种核苷类物质总提取量为1.4216±0.0198 mg/g，高于理论值1.3434 mg/g，表明优化的工艺条件（以纯净水为提取溶剂，在料液比1∶10、30 ℃条件下超声波提取60 min，提取2次）有效提高了核苷类物质的提取量，且合理、可行。

3 讨论

目前，大多数核苷提取工艺优化的研究集中在贝母、党参、虫草等药用植物，且多利用超声波提取和热水浸提方法，以核苷总量为考察指标（江宝红等，2011；王丽芝等，2011；陈家念等，2014；张静等，2016）。本研究通过对比超声波提取和热水浸提两种提取方式对滇重楼根茎中核苷类物质提取量的影响，发现超声波提取的效果更佳，故采用此法进行后续研究，并通过单因素试验和正交试验考察甲醇体积分数、提取时间、料液比和提取次数等因素对滇重楼根茎中核苷类物质提取量的影响，结果表明，甲醇体积分数是影响滇重樓根茎核苷总提取量的最主要因素，而料液比的影响较小，与张静等（2016）采用超声波辅助提取川党参核苷时，发现甲醇体积分数是影响川党参核苷提取量的主要因素的研究结果一致。本研究通过正交试验优化得到滇重楼核苷的最佳提取工艺条件：以纯净水为提取溶剂，在料液比1∶10、30 ℃条件下超声波提取60 min，提取2次，提取量达1.4216±0.0198 mg/g，可反映滇重楼根茎中核苷类物质的实际含量，为进一步开发其药用价值提供参考。

中药材传统多以水煎煮为主，其水溶性成分的生物活性和物质基础一直备受关注（王丽芝等，2011）。而滇重楼的水溶性化学成分主要是核苷类物质，与滇重楼生物活性（抗肿瘤、抗病毒、调节免疫等）具有一定的相关性（陈源红等，2013；潘兴娇等，2016）。与传统加热回流和浸提相比，超声波提取可缩短提取时间，降低提取温度（李维莉等，2010），本研究优化的提取工艺以纯净水为提取溶剂，价廉易得，提取率高。目前，有关滇重楼中核苷类物质的药用价值研究尚处于基础阶段，本研究优化的提取工艺可为重楼核苷化学物质组学和生物活性的深入研究和开发利用提供技术支持。

4 结论

优化得到滇重楼核苷类物质提取的最佳工艺条件：以纯净水（甲醇体积分数为0）为提取溶剂，在料液比1∶10、30 ℃条件下超声波提取60 min，提取2次，得到滇重楼根茎中胞苷、尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷和2'-脱氧腺苷的总提取量为1.4216±0.0198 mg/g。该工艺操作简便、稳定可靠，较热水浸透法的提取效率高，适合用于滇重楼核苷的提取。

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（责任编辑 罗 丽）