白细胞介素-21和Blimp1 mRNA在老年类风湿关节炎患者外周血单个核细胞的表达及作用机制

侯艳香

(山西医科大学汾阳学院医学检验系，山西 汾阳 032200)

白细胞介素-21和Blimp1 mRNA在老年类风湿关节炎患者外周血单个核细胞的表达及作用机制

侯艳香

(山西医科大学汾阳学院医学检验系，山西 汾阳 032200)

目的探讨白细胞介素(IL)-21和Blimp1 mRNA在老年类风湿关节炎患者外周血单个核细胞(PBMCs)的表达及作用机制。方法老年类风湿关节炎患者62例，同期体检的健康老年人45名作为对照。取外周静脉血分离PBMC和血浆，酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血浆中IL-21水平，分析DAS28、抗CCP抗体与IL-21的相关性；实时荧光定量PCR检测患者PBMCs中Blimp1 mRNA表达量；使用IL-21、CD40L刺激PBMCs 72 h后检测Blimp1 mRNA表达量，流式细胞术检测各组CD138+细胞比例。结果类风湿关节炎患者血浆IL-21含量明显高于对照组(P<0.01)。血浆IL-21含量与类风湿关节炎患者DAS28、抗CCP抗体具有明显相关性(r=0.769、0.785，P<0.05)。类风湿关节炎患者PBMCs中Blimp1 mRNA表达量明显高于对照组(P<0.05)。IL-21、CD40L体外刺激后，对照组与CD40L组Blimp1 mRNA表达水平之间差异无统计学意义(P>0.05)；IL-21组、IL-21+CD40L组Blimp1 mRNA表达水平均明显高于对照组(P<0.01)；IL-21+CD40L组明显高于IL-21组(P<0.05)。流式细胞术显示，IL-21+CD40L组CD138+细胞比例明显高于CD40L组和IL-21组(P<0.05)。结论IL-21可促进老年类风湿关节炎患者PBMCs中Blimp1 mRNA表达，IL-21与CD40L协同作用可通过调节Blimp1 mRNA表达促进B淋巴细胞分化并参与类风湿性关节炎的发病。

类风湿关节炎；白细胞介素-21；Blimp1

老年类风湿关节炎患者多合并心肺等基础疾病，病情进展迅速且易反复，治疗难度大〔1〕。研究发现，白细胞介素(IL)-21可能通过JAK-STAT通路诱导B淋巴细胞分化为浆细胞〔2〕，但是否存在其他调控机制仍需进一步研究。Blimp1可转录调节B淋巴细胞分化和浆细胞分泌免疫球蛋白，其在自身免疫方面作用研究较少。类风湿关节炎属于自身免疫性疾病，存在类风湿因子、抗CCP抗体异常升高等B淋巴细胞相关异常改变〔3〕。目前关于风湿关节炎患者体内Blimp1表达情况和IL-21的调节作用仍鲜有报道，本研究旨在分析老年类风湿关节炎患者体内Blimp1和IL-21的表达情况及作用机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年1月至2016年6月医院收治确诊为类风湿关节炎的老年患者62例，其中男17例，女45例；年龄60～75岁，平均(67.31±6.08)岁；关节活动指数为(4±1)，处于风湿关节炎中度活动期；给予口服甲氨蝶呤15 mg/w与盐酸泼尼松片10 mg/d联合治疗。选择同期在本院体检的健康老年人45名为对照组，其中男38名，女7名；年龄60～78岁，平均(68.15±7.20)岁。入选受试者采血前未使用抗凝剂，采集的空腹肘静脉血经抗凝处理后无明显溶血，两组性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2主要试剂与仪器 人外周血淋巴细胞分离液(上海朗顿生物科技有限公司)，RT-PCR试剂盒、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，Trizol试剂(杭州新景生物试剂开发有限公司)，CD40L、CD20PE、CD138PE抗体(南京森贝伽生物科技有限公司)。罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪，贝克曼Quanta SC流式细胞仪。

1.3方法

1.3.1血浆IL-21水平检测 采用ELISA法检测，将100 μl血浆和各浓度标准品溶液加入96孔板，每孔加入100 μl的酶标志物，放入37℃保温箱中反应60 min，甩去孔内液体，磷酸缓冲液洗涤后晾干，加显色液A和B，振荡混匀后放入暗室中反应20 min，加终止液，放入酶标仪读取450 nm波长处每孔的吸光度值。

1.3.2实时荧光定量PCR检测 提取两组外周单个核细胞(PBMCs)总RNA，检测纯度符合反转录要求后合成cDNA；实时荧光定量PCR反应总Blimp1 mRNA表达量，反应体系20 μl(cDNA 2 μl，上游引物、下游引物各1 μl，TaqDNA聚合酶10 μl，蒸馏水6 μl)。常规反应条件下共40个循环，以健康老年人为对照计算类风湿关节炎患者mRNA相对表达量。

1.3.3类风湿关节炎患者PBMCs培养及Blimp1 mRNA表达检测 将分离的PBMCs用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基调整密度为1×106/ml并加入96孔板，每孔200 μl，放入CO2细胞培养箱中孵育。依据细胞培养孔中是否加IL-21、CD40L将PBMCs分为空白对照组、IL-21组(200 ng/ml)、CD40L组(5 μg/ml)、IL-21+CD40L组，均孵育48 h，Trizol法提取细胞总RNA并测定其浓度，吸光度值1.8～2.0，放入超低温冰箱中冻存。荧光定量PCR测定IL-21刺激对Blimp1 mRNA表达的影响，流式细胞术检测IL-21+CD40L刺激后PBMCs培养72 h后细胞中CD138+细胞的比例，使用FlowJo 7.6软件分析。

1.4统计学分析 使用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1两组IL-21含量比较 观察组IL-21含量为(129.62±9.48)ng/L，明显高于对照组的(26.57±5.85)ng/L(P<0.01)。血浆IL-21含量与类风湿关节炎患者DAS28、抗CCP抗体具有明显相关性(r=0.769、0.785，P<0.05)。见图1。

图1 IL-21与类风湿关节炎患者DAS28、抗CCP抗体的相关性

2.2两组PBMCs中Blimp1 mRNA表达情况 观察组PBMCs中Blimp1 mRNA表达量(1.43±0.22)明显高于对照组(1.00±0.00)(P<0.05)。

2.3IL-21、CD40L刺激对PBMCs中Blimp1 mRNA表达的影响 对照组、CD40L组、IL-21组、IL-21+CD40L组的Blimp1 mRNA表达量分别(1.00±0.00)、(1.03±0.05)、(1.19±0.03)、(1.26±0.05)，4组差异有统计学意义(P<0.05)；其中对照组与CD40L组差异无统计学意义(P>0.05)；IL-21组、IL-21+CD40L组明显高于对照组(P<0.01)；IL-21+CD40L组明显高于IL-21组(P<0.05)。

2.4IL-21、CD40L刺激对PBMCs中CD138+细胞比例的影响 CD40L组、IL-21组、IL-21+CD40L组CD138+细胞比例分别为(0.58±0.22)、(0.76±0.24)、(0.92±0.28)，其中IL-21+CD40L组明显高于CD40L组和IL-21组(P<0.05)。

3 讨 论

研究发现，类风湿关节炎的发病机制除T淋巴细胞活化外还与B淋巴细胞功能亢进相关，B淋巴细胞可通过抗原传递、分泌细胞因子、产生自身抗体等途径在促进类风湿关节炎病情进展〔4〕。目前B淋巴细胞清除疗法已在类风湿关节炎患者中取得较好的疗效。细胞因子可在淋巴细胞活化、细胞间信号传导方面起到重要作用，也参与了类风湿关节炎患者滑膜炎性病变过程〔5〕。尽管目前靶向淋巴细胞和炎性细胞因子共刺激等治疗手段快速发展，但疗效仍不理想，同时较严重的不良反应更是严重影响老年类风湿关节炎患者的预后。

IL-21可与IL-21R结合后对机体免疫系统中多种细胞增殖、分化、功能成熟发挥调节作用。相关研究显示，IL-21可有效促进类风湿关节炎患者CD4+T细胞活化和破骨细胞生成，发挥骨折破坏、刺激滑膜中金属蛋白酶释放的作用，参与关节病变的进展〔6〕，阻断IL-21有望成为类风湿关节炎治疗的新途径。在CD40刺激下IL-21可刺激B淋巴细胞快速增殖、浆细胞分化，Blimp1基因是浆细胞分化的重要调控子，是浆细胞生成和维持的重要条件，有研究发现，Blimp1基因异常表达可促使B细胞系分化为浆细胞〔7〕。CD138是浆细胞中特异性抗原，可作为成熟浆细胞的特异性标志物，CD138+细胞比例增加提示浆细胞数增加与Blimp1基因高表达。

1Chu Y，Wang F，Zhou M,etal.A preliminary study on the characterization of follicular helper T (Tfh) cells in rheumatoid arthritis synovium〔J〕.Acta Histochemica，2014；116(3)：539-43.

2孙 波，宋玉国，王 华，等.类风湿关节炎患者关节液中IL-17的定量检测〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2014；15(5)：620-2.

3林锦骠.Cyr61在类风湿性关节炎炎症微环境中的作用及其调控机制〔D〕.上海：上海交通大学，2013.

4Huang QQ，Pope RM.The role of glycoprotein 96 in the persistent inflammation of rheumatoid arthritis〔J〕.Arch Biochem Biophys，2013；530(1)：1-6.

5Lee SS，Xin XH，Lee WP,etal.The feasibility of using SMS as a health survey tool：an exploratory study in patients with rheumatoid arthritis〔J〕.Int J Med Inform，2013；82(5)：427-34.

6吴昌顺.Furin和PCSK6对类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞生物学功能的影响〔D〕.济南：山东大学，2015.

7Gabriel D，Lange N，Chobaz-Peclat V，etal.Thrombin-sensitive dual fluores imaging and therapeutic agent for detection and treatment of synovial inflammation in murine rheumatoid arthritis〔J〕.J Control Release，2012；163(2)：178-86.

〔2016-10-18修回〕

(编辑 郭 菁/滕欣航)

侯艳香(1977-)，女，实验师，主要从事临床检验及血液检验研究。

R593.22

A

1005-9202(2017)17-4209-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.018