洋金花提取物对单胺氧化酶B的抑制作用研究

李冰+宫彬彬+王亮亮

【摘要】 目的 研究洋金花对单胺氧化酶B（MAO-B）的抑制效果及抑制类型。方法 采用醇提水沉法对洋金花不同部位进行提取， 获得提取物， 并计算得率。利用分光光度法研究了洋金花不同部位提取物对MAO-B的抑制作用。对花提取物抑制数据进行分析， 求得花提取物对MAO-B的半数抑制浓度IC50值。进一步对花提取物抑制MAO-B的动力学进行考察， 根据双倒数曲线结果判定抑制机制。结果 洋金花提取物对MAO-B有抑制作用， 花部位提取物抑制效果最强， 浓度为1 mg/ml时， 对MAO-B的抑制率为（55.74±1.5）%， 半数抑制浓度IC50为0.75 mg/ml。抑制动力学研究结果表明， 洋金花提取物对MAO-B的抑制作用属于混合型抑制。结论 洋金花提取物对MAO-B具有明显抑制作用， 属于混合性抑制， 这可能是洋金花对PD具治疗作用的机制之一。

【关键词】 单胺氧化酶B；抑制；洋金花；帕金森病

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.01.118

【Abstract】 Objective To study the inhibitory effect and types of Datura metel L. extract on monoamine oxidase B （MAO）-B. Methods Alcohol extraction water sedimentation method was used to obtain fractions from different parts of Datura metel L.， and the yields of the extracts were calculated. Spectrophotometry was used to study the inhibitory effect of different parts of Datura metel L. on MAO-B. The inhibition data of flower extract were analyzed， and the IC50 value of half inhibitory concentration of flower extract to MAO-B was obtained. The kinetics of MAO-B inhibition was further investigated， and the inhibition mechanism was determined according to the results of the double reciprocal curve. Results The extracts of Datura metel L. had the inhibitory effect on MAO-B， and the extracts of flower parts had the strongest inhibitory effect. The inhibitory rate of MAO-B was （55.74±1.5）% at the concentration of 1 mg/ml and the IC50 was 0.75 mg/ml. Inhibition kinetics showed that the inhibitory effect of Datura metel L. on MAO-B was mixed type inhibition. Conclusion Datura metel L. has obvious inhibitory effect on MAO-B， which belongs to the mixed inhibition. It may be one of the mechanisms of Datura metel L. in healing PD.

【Key words】 Monoamine oxidase B； Inhibitory； Datura metel L.； Parkinsons disease

MAO是位于线粒体外膜上的一种黄素蛋白， 包括单胺氧化酶A（MAO-A）和MAO-B两种亚型， 能催化多种单胺类神经递质氧化脱氨[1]， 同时释放过氧化氢， 造成细胞氧化应激。氧化应激是帕金森病（Parkinsons disease， PD）重要发病机制之一[2]， 研究表明， PD发病与MAO活性异常升高密切相关[3]。MAO-B抑制剂在治疗PD中具有其独特优势， 如长期使用不会产生精神障碍、运动并发症、异动症等不良反应[4]。探索和开发新型的MAO-B抑制剂已经成为临床研究的热点方向[5]。洋金花（Datura metel L.）又名白花曼陀罗， 为茄科（Solanaceae）曼陀罗属植物， 主要成分有生物碱类、黄酮类、醉茄内酯类、木质素类、倍半萜类及酚酸类等， 藥用历史悠久， 具有平喘止咳、解痉镇痛[6]、抗惊厥[7]、抗氧化[8] 等功效。药理活性广泛， 可用于治疗银屑病[9]、类风湿[10]、慢性气管炎[11]及精神分裂症[12]等， 也可用于外科麻醉[13]。孙申田等[14]研究表明， 洋金花能有效改善PD患者的临床症状， 对PD具有一定治疗作用， 但并未对其治疗作用机制进行研究。鉴于此， 本文对洋金花治疗PD的机理进行了初步探究， 研究了洋金花提取物对MAO-B的抑制效果， 并对其抑制动力学进行了研究。

1 材料与方法

1. 1 主要仪器及试剂 UV-5200型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）、TGL-20M型台式高速冷冻离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司）、KQ-250DE型医用数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、RE-3000B型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。盐酸司来吉兰购置于SIGMA公司， 其他试剂均为分析纯。endprint

1. 2 实验材料 曼陀罗采于邢台学院校园北门， 由邢台学院化学工程与生物技术学院唐伟斌教授鉴定。健康Wistar大鼠， 购于河北省实验动物中心， 许可证号：SCXK（冀）2003-1-003。

1. 3 方法

1. 3. 1 植物提取物的制备 将植物材料阴干， 粉碎后过

80目筛。用索氏提取法以95%的乙醇、90℃回流提取8 h。滤液减压蒸发， 加入少量蒸馏水， 超声震荡。静置过夜后将滤液离心， 弃沉淀取上清。将上清液水浴蒸干， 105℃烘干至恒重。置干燥器中冷却30 min， 迅速精密称定重量[15]。测定得率。

1. 3. 2 MAO的制备与酶活测定 以Wistar大鼠肝组织为材料提取MAO， 提取方法参考文献[16]。酶活测定参照文献[17]。以MAO-B的特异性底物苄胺制备反应体系， 其产物苯甲醛在250 nm处有最大光吸收， 利用分光光度法对MAO-B酶活进行检测。反应体系为磷酸钾缓冲液（0.2 M， pH 7.4）， 包含MAO（蛋白浓度为2 mg/ml）， 苄胺。将反应体系于37℃孵育1 h。随后终止反应， 测定酶活。

1. 3. 3 洋金花提取物对MAO-B的抑制作用 考察洋金花不同部位提取物对MAO-B的抑制作用。反应体系制备同“2.2”， 苄胺浓度固定为其米氏常数Km（0.1 mM[18] ）， 并向其中加入洋金花不同部位提取物（根、茎、叶、花、果实、种子）， 终浓度均为1 mg/ml。以不加入植物提取物的反应体系为对照， 分别测定酶活， 计算抑制率。

1. 3. 4 洋金花花提取物对MAO-B的半数抑制浓度IC50值测定 反应体系制备同“2.2”， 向其中分别加入不同浓度洋金花花提取物（0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml）， 考察对MAO-B的抑制作用。分析数据， 计算IC50值。

1. 3. 5 洋金花提取物对MAO-B抑制动力学考察 反应体系制备同“2.2”， 向反应体系中加入不同浓度苄胺（0.1、0.2、0.4 mM）， 考察不同浓度洋金花提取物（0、1 mg/ml）对反应速率的影响。以吸光度值作为反应速率V， 底物苄胺浓度

为[S]， 以1/V对1/[S]作图， 得到洋金花提取物对MAO-B抑制作用的双倒数曲线图， 根据直线相交情况判定抑制作用机制。

2 结果

2. 1 洋金花不同部位提取物对MAO-B的抑制作用 将底物苄胺浓度固定为其米氏常数Km， 考察洋金花不同部位提取物对MAO-B的抑制作用。洋金花花部位提取物对MAO-B的抑制作用最强， 为（55.74±1.5）%， 且提取物得率较高为17.40%；其次为果实、叶、茎、根， 而种子提取物对MAO-B的抑制作用最弱， 仅为（4.37±2.9）%。见表1。孙申田等[14]正是以洋金花花部位研成全粉， 取适量入胶囊对PD患者进行治疗。

2. 2 洋金花花提取物对MAO-B的量效抑制关系及IC50值

鉴于花的提取物对MAO-B的抑制作用最强， 因此， 选取花提取物作为抑制剂对MAO-B的量效抑制关系进行考察， 分别选抑制剂取浓度为0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml制备反应体系， 以不加抑制剂的体系做对照， 固定各反应体系中苄胺浓度为Km， 求得各浓度抑制剂对MAO-B的抑制率， 并计算其对MAO-B的半数抑制浓度IC50值。见图1。随着花提取物浓度的逐渐增加， MAO-B受到的抑制作用也越强。用GraphPad Prism 6对不同浓度下的抑制率数据进行分析， 得到当底物苄胺浓度为其米氏常数Km值时， 洋金花花部位提取物对MAO-B的半数抑制浓度IC50， 司来吉兰为阳性对照。见表2。

2. 3 洋金花花提取物对MAO-B的抑制机制考察 酶可逆性抑制剂的作用机理主要有4種， 即竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制及混合型抑制。对抑制类型的判断主要是通过Lineweaver-Burk双倒数曲线法确定。竞争性抑制作用中， 双倒数图中各曲线与x轴交汇于一点；非竞争作用中， 各曲线与y轴交汇于一点；反竞争作用中， 各曲线平行；而混合型抑制作用中， 各曲线交汇于第二或第三象限。从洋金花花提取物对MAO-B抑制作用的双倒数图来看， 各曲线于第三象限交汇于一点， 属于混合型抑制作用。见图2。

3 小结

本文对洋金花治疗PD的机理进行了初步的探究。发现洋金花花提取物对MAO-B抑制效果最强， 抑制机制为混合型抑制， 表明提取物中含有MAO-B的可逆性抑制剂。MAO-B可逆性抑制剂在治疗PD中具有其独特优势， 如导致不良反应的倾向较小等， 这可能是洋金花治疗PD的机制之一。是否具有其他治疗作用机制还有待进一步考察。近年来从植物天然产物中寻找MAO-B抑制剂的研究越来越多， 目前已发现的MAO-B抑制剂包括生物碱、香豆素、黄酮、蒽醌类化合物等[19]。洋金花醇提水沉提取物中的有效成分还需进一步研究。

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[收稿日期：2017-10-10]endprint