HPLC法同时测定鼠曲草不同部位中3种黄酮类成分含量

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1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350108；2.福建医科大学附属协和医院，福建 福州 350001

鼠曲草又名佛耳草、清明菜、白艾，系菊科鼠曲草属植物GnaphaliumaffineD.Don，全草入药，收载于1977年版《中华人民共和国药典》一部中[1]。多生于路旁、田边、山坡草地等处，我国黄河流域以南各省区均有分布，也见于墨西哥、阿根廷、危地马拉、玻利维亚等中南美洲国家。据报道，鼠曲草全草中含有5%黄酮苷[2]，是鼠曲草主要的活性成分。黄酮类化合物药理活性丰富，具有抗菌抗氧化[3-7]、改善糖尿病血脂紊乱[8]、止咳祛痰[9]、保肝[10]、镇痛[11]、抗炎[12-14]，改善气道炎症[15]和胶原诱导的关节炎症状[16]的作用，对高尿酸血症和痛风性关节炎[17]也有一定的治疗作用等，在南非国家用鼠曲草来治疗呼吸道和肠胃道疾病[18]。

本研究拟采用高效液相色谱技术，建立同时测定鼠曲草中槲皮素、木犀草素和芹菜素的检测方法，并将该方法应用于鼠曲草不同部位中3种黄酮类化合物的分析检测，为鼠曲草总黄酮和黄酮类化合物的开发利用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 材料 鼠曲草购自福建中医药大学承创堂，芦丁(≥98%，Rutinhydrate，批号：100080-201610，中国食品药品检定研究院)、槲皮素(≥98%，Quercetin，批号：C20J6Y1722，上海源叶生物科技有限公司)、木犀草素(≥98%，Luteolin，批号：C10016987，上海麦克林生化科技有限公司)、芹菜素(≥98%，Apigenin，批号：K27A6C1，上海源叶生物科技有限公司)。甲醇(色谱纯，德国默克公司)、磷酸(分析纯，批号：20160521，天津市恒兴化学试剂制造有限公司)、乙醇(分析纯，批号：20170311，国药集团化学试剂有限公司)、氢氧化钠(分析纯，批号：1404102，西陇化工股份有限公司)、亚硝酸钠(分析纯，批号：1608011，上海联试化工试剂有限公司)、硝酸铝(分析纯，厂家：天津市恒兴化学试剂制造有限公司，批号：20160426)、Na2CO3(分析纯，批号：20130613，国药集团化学试剂有限公司)，水为超纯水。

1.2 仪器 Ultimate-3000型高效液相色谱仪(美国戴安公司)、UV-1800紫外分光光度计(日本岛津)、KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、XS105型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)、HH-4数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Diamonsil-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：甲醇-0.2%磷酸(50∶50)；检测波长：360 nm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。理论塔板数按槲皮素、木犀草素、芹菜素峰计，应分别不低于5000、6000、7000。色谱图如图1所示。

2.2 测定波长的选择 将槲皮素、木犀草素、芹菜素分别溶解于甲醇中，使其浓度约为10 μg/mL，用紫外-可见分光光度计在190～400 nm的波长范围内进行扫描，得到吸收曲线如图2所示，因为考虑到同时检测，所以选择360 nm作为测定波长。

2.3 对照品溶液的制备 分别精密称取槲皮素6.08 mg于10 mL容量瓶、木犀草素1.47 mg于2 mL容量瓶、芹菜素2.35 mg于5 mL容量瓶，加甲醇溶解，定容置刻度线，得到浓度为0.608 mg/mL槲皮素、0.735 mg/mL木犀草素、0.470 mg/mL芹菜素储备液，再分别精密吸取1 mL上述储备液于5 mL容量瓶，加甲醇定容置刻度线，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤液作为混合对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备[19]分别称取5 g花、茎、叶、鼠曲草，按照料液比1∶35加入65%乙醇，超声波辅助提取两次(超声波功率350 W，提取温度35 ℃)，每次35 min，合并提取液，过滤，浓缩，定容至25 mL容量瓶，摇匀，静置。经0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液，平行做三份供试品溶液。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定槲皮素、木犀草素、芹菜素，以进样量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，得到3种成分的回归方程，相关系数与线性范围。见表1。

表1 回归方程、相关系数与线性范围

2.5.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，测得槲皮素、木犀草素、芹菜素峰面积的RSD分别为0.66%、0.64%、0.94%，表明仪器的精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，于室温放置 0、2、4、6、8、12、24 h，精密吸取 10 μL，按“2.1”项色谱条件进样分析，计算各色谱峰面积的RSD值，结果槲皮素、木犀草素、芹菜素各组分峰面积的RSD值分别为2.43%、2.87%、2.09%，均小于 3.0%，表明供试品溶液在 24 h 内稳定性良好。

2.5.4 重复性试验 称取同一样品5份，按照“2.4”项下的方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下的色谱条件进样10 μL，测得槲皮素、木犀草素、芹菜素质量分数的RSD分别为1.59%、1.13%、1.89%，表明该方法重现性良好。

2.5.5 加样回收试验 精密称取已知含量的鼠曲草样品2.5 g 共6份，分别置250 mL具塞锥形瓶中，分别加入槲皮素、木犀草素和芹菜素的对照品溶液适量，按照“2.4”项下的方法处理样品，按“2.1”项下的色谱条件进行测定各待测成分的量，计算回收率与RSD值。回收率试验结果表明，槲皮素、木犀草素、芹菜素的平均回收率分别为99.18%、100.73%、98.70%，RSD值分别为: 1.92%、2.27%、2.56%。见表2。

2.6 样品测定 按照“2.1”项下的色谱条件对鼠曲草不同部位和全草中的槲皮素、木犀草素、芹菜素的含量进行测定。色谱图如图3所示，其结果见表3。

表3 鼠曲草中3种黄酮类化合物含量的HPLC法检测结果 /μg/g

注：“□”表示未检出

3 讨论

3.1 色谱条件的确定 将槲皮素、木犀草素、芹菜素配制成混合对照品，进行液相色谱分析，因3种黄酮均含有多个酚羟基，具有一定的酸性，为保证实验获得较好的峰形，采用一定浓度的磷酸调节流动相的PH值，改善分离效果。实验最终以0.2%磷酸溶液作为缓冲剂，可得到较好的色谱峰。实验以乙腈和磷酸作为流动相，但由于样品基质复杂，杂峰对上述3种化合物的峰有干扰且分离度没有达到规定要求，实验中发现甲醇-水体系较乙腈-水体系更有利于待测化合物的分离；所以选择甲醇-0.2%磷酸溶液作为洗脱剂；实验表明等度洗脱更有利于物质的分离，经过多次优化实验确定“2.1”项下所示的色谱条件。该条件既可缩短样品中槲皮素、木犀草素、芹菜素3种待测黄酮化合物的分析时间，又能达到较好的分离效果。

3.2 不同部位3种黄酮类化合物的含量测定 从表2和图3中数据可知，用HPLC法同时测定鼠曲草全草和花中3种黄酮类化合物，花和鼠曲草中槲皮素、木犀草素、芹菜素的含量均不相同，花中3种黄酮类成分的量均最高，同时其含量又是木犀草素>槲皮素>芹菜素，茎和叶中未检测出这3种成分或量过低没有达到检测限，从而推测鼠曲草中槲皮素、木犀草素、芹菜素这3种成分主要分布在花中。

我国鼠曲草资源丰富，分布广泛，可药食两用。鼠曲草中富含黄酮类成分，具有多种药理活性，是一种极具开发利用潜质的生物资源。但是目前国内对鼠曲草的研究较少，尤其是对鼠曲草的化学成分以及定量测定的研究相对较少，这是对鼠曲草利用价值的极大浪费。本实验利用HPLC法分析鼠曲草各部位中3种黄酮类成分的分布情况，方法学考察表明，所建立的方法线性关系和重复性良好，结果准确，可用于鼠曲草不同部位槲皮素、木犀草素、芹菜素的定量分析。

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