反相高效液相色谱法联合测定食品中多种防腐剂、甜味剂及富马酸二甲酯

□ 柏中波 王 晶 张国莹 辽宁通正检测有限公司

食品中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸等防腐剂、非食品添加剂富马酸二甲酯以及糖精钠、乙酰磺胺酸钾、阿斯巴甜和阿力甜4种甜味剂在食品中应用非常广泛，且在GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中有明确的使用限定。本文主要目的就是在更短的样品处理和检测时间下，更简便的操作方法下，将8种物质联合检测出来。

1 材料及方法

1.1 试剂和材料

1.1.1 试剂

①亚铁氰化钾溶液（92 g/L）：称取106 g三水合亚铁氰化钾，加入适量水溶解，用水定容至1 000 mL。②乙酸锌溶液（183 g/L）：称取220 g二水乙酸锌超声使溶于500 mL水中，量取30 mL冰乙酸加入，最后用水定容至1 000 mL。③乙酸铵溶液（0.02 mol/L）：称取3.08 g乙酸铵，用少量水转移至1 L容量瓶中，加水定容。过0.45 μm水相微孔滤膜后超声脱气备用。

1.1.2 标准物质

水中乙酰磺胺酸钾、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸、阿斯巴甜、富马酸二甲酯、阿力甜。

1.1.3 标准曲线绘制

分别吸取适量体积的标准品于1 mL容量瓶，用水定容后得到标准曲线。

1.2 仪器和设备

岛津LC-20A，带二极管阵列（PDA）检测器；分析天平，感量为0.001 g和0.000 01 g；超声波清洗仪；涡旋振荡器；离心机，转速＞8 000 r/min。

1.3 色谱条件

C18柱，内径4.6 mm，粒径5 μm，柱长150 mm。

流动相：溶剂A，0.02 mol/L乙酸铵溶液；溶剂B，甲醇。

梯度洗脱程序：0～5 min，流速 1～ 0.8 mL/min， 甲 醇 5%；5～20 min， 流 速0.8～1mL/min， 甲 醇10%；20～40 min，流速1 mL/min，甲醇38%；40～48 min，甲醇5%。

进样量：20 μL，柱温30 ℃。

检测波长：阿斯巴甜和阿力甜，200 nm；富马酸二甲酯，220 nm；乙酰磺胺酸钾、苯甲酸、山梨酸、糖精钠，230 nm；脱氢乙酸，293 nm。

1.4 试样处理

分别准确称取约2.5 g（精确到0.001 g）的试样于50 mL具塞离心管中，用10 mL移液枪准确加入18 mL甲醇水（1+1）溶液，旋紧盖子后涡旋使充分混匀，于50 ℃水浴条件下超声震荡30 min，取出后充分震荡30 s，待冷却至室温后加入2 mL亚铁氰化钾溶液和2 mL乙酸锌溶液，再次旋紧盖子涡旋震荡30 s，使提取液充分混匀后于9 000 r/min条件下离心1 min，取适量上清液过0.22 μm有机系滤膜，弃去前3滴，待液相色谱测定（当样品澄清透明且不含蛋白质时，如碳酸饮料、果酒、果汁、蒸馏酒等，可不加沉淀剂，直接加入4 mL水，摇匀后过膜上机）。

2 结果及分析

2.1 色谱条件选择

2.1.1 梯度洗脱程序建立

在设定初始浓度甲醇+乙酸铵=5+95和4+96时，糖精钠和脱氢乙酸出峰时间重合，无法对两个色谱峰进行单独的积分计算。调整洗脱比例为甲醇+乙酸铵=10+90，流速为1 mL/min时分离度为1.547，调整流速为0.8 mL/min时分离度为1.698。而乙酰磺胺酸钾在洗脱比例为甲醇+乙酸铵=5+95，流速为1 mL/min时出峰时间为6.98 min，才能和样品中其他干扰杂峰相对分离开。因此，在梯度洗脱过程中选择初始条件为时间0～5 min，流速从1 mL/min降至0.8 mL/min，甲醇比例在5 min处从5%改成10%。因为阿斯巴甜、阿力甜和富马酸二甲酯三种物质在甲醇+乙酸铵=5+95等度洗脱时，出峰时间较晚，分析效率低。在20 min后调整流动相比例为甲醇+乙酸铵=62+38时，3种物质保留时间在28 min后，基线平稳，分离度达到1.5以上，峰展宽适中，所以梯度洗脱程序设定为在20 min后，调整甲醇+乙酸铵=62+38，并保持20 min，在40 min后调整回初始浓度，保持8 min使基线重新平稳。

2.1.2 波长选择

由PDA光谱图可知阿斯巴甜和阿力甜在200 nm处有最大吸收；富马酸二甲酯和脱氢乙酸分别在220 nm和293 nm处有最大吸收；而乙酰磺胺酸钾、苯甲酸、山梨酸、糖精钠4种物质在230 nm波长下吸收值较大，标准曲线线性良好，且来自流动相的基质干扰小，所以选定230 nm做4种物质的检测波长。

具体标准品色谱图如图1-3所示。

图1 阿斯巴甜及阿力甜色谱图

图2 乙酰磺胺酸钾、苯甲酸、山梨酸及糖精钠色谱图

图3 脱氢乙酸色谱图

表1 添加回收结果数据统计表

2.2 线性范围及相关系数

对实验方法进行方法学考察验证，其中乙酰磺胺酸钾标准线性范围在2～20µ g/mL时线性关系良好，相关系数R2为0.999 76；苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准线性范围在0～100 µg/mL时线性关系良好，相关系数R2分别为0.999 66、0.999 97、0.999 98；脱氢乙酸标准 线 性 范 围 在 1µ ～ 100 µg/mL 时 线 性关系良好，相关系数R2为0.999 98；阿斯巴甜和阿力甜标准线性范围在0～100 µg/mL时线性关系良好，相关系数R2分别为0.999 36、0.999 69；富马酸二甲酯标准线性范围在2～25 µg/mL时线性关系良好，相关系数R2为 0.999 38。

分别准确称取约2.5 g纯牛奶、凉拌土豆丝、鸡肉、酥饼试样各6份，添加标准物质量及回收率、变异系数见表1。

3 小结

本方法及本色谱条件对食品中的苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸3种防腐剂，非食品添加剂富马酸二甲酯，以及糖精钠、乙酰磺胺酸钾、阿斯巴甜和阿力甜4种甜味剂的检测，不仅操作方法方便快捷，分析时间短，结果精密度及准确度好，更利于提高工作效率，适用于大批量样品的检测。