高盐稀态酱油中微生物的协同作用

□ 牛丽丽 何琳琳 天津市利民调料有限公司

酱油发酵过程实质是微生物的代谢过程。原料中的蛋白质原料、淀粉质原料等在蛋白酶、糖化酶等各种酶作用下，经过复杂的代谢过程，最终发酵成酱油。高盐稀态酱油酿造过程中需要多种类微生物的协同作用。这些微生物包括米曲霉、酵母菌、乳酸菌及其他细菌。微生物通过自身正常代谢，能够生成不同的代谢产物。与此同时，微生物的自溶作用也会释放出来多种营养物质，这些物质经过相互反应和多级转化，构成了酱油的丰富内容物。

1 霉菌类（Aspergillus）

1.1 米曲霉（Aspergillus oryzae）

米曲霉是酱油酿造中使用最广泛的一种微生物。国内酱油生产厂家普遍使用沪酿3.042菌株，其菌粉的制作也已实现工业化。米曲霉制作大曲的过程中，温度应控制在35～37℃，水分控制在45%～55%，湿度控制在90%～100%，此条件能够保证菌丝生长良好，同时有利于菌体中酶的释放[1]。

米曲霉在酱醪中通过复杂的酶系发挥作用。蛋白酶可将肽键水解，肽键水解后，蛋白质分解为小分子的蛋白胨、肽或氨基酸[2]。米曲霉在制曲过程中会分泌中性蛋白酶和碱性蛋白酶[3]。中性蛋白酶有肽链内切酶属性，在水解蛋白质时，可切断8%～15%的肽链。在酱油发酵过程中，中性蛋白酶主要催化大豆蛋白水解[4]。

谷氨酰胺酶是一种胞内酶，只有在菌体自溶后才可发挥作用。谷氨酰胺酶可催化谷氨酰胺，将其水解成谷氨酸，从而增加酱油呈鲜。

淀粉类原料经蒸煮后被完全糊化。经α-淀粉酶催化，淀粉类原料被分解成糊精和糖。这使得淀粉黏度降低，糖化酶可继续作用于糊精，可使短分子的糊精全部变成麦芽糖或葡萄糖[5]。

1.2 黑曲霉（Aspergillus niger）

黑曲霉多用于与米曲霉混合制曲发酵酱油，可以使酱油中谷氨酸上升到全氮60 %左右。经测定分析发现，黑曲霉中酸性蛋白酶含量比沪酿3.042增加16倍。其所含的纤维素酶、果胶酶都比沪酿3.042有明显的增加。这类植物组织溶解酶能崩溃植物细胞壁，使蛋白质和淀粉暴露出来对米曲酶的蛋白酶有互补作用[6]。

2 酵母菌（Zygosaccharomyces）

高盐稀态酿造酱油工艺中，研究证明可以添加的酵母包括主发酵酵母和后熟发酵酵母。主发酵酵母主要指鲁氏接合酵母，在发酵前期加入。后熟发酵酵母主要指多变假丝酵母、球拟酵母等[7]。

2.1 鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）

鲁氏接合酵母耐渗透压能力强，最适生长温度30℃。可在含盐量和含糖量很高的环境中生长，其最适耐盐量5%～8%，在盐量18%的情况下，仍能生长良好。因此可在发酵前期添加扩大培养的酵母液，丰富酱油风味。

鲁氏接合酵母可代谢出乙醇、4-羟基-呋喃酮类、高级醇等物质，这些物质对酱油风味的形成起到了关键性作用。葡萄糖或麦芽糖等糖类物质，在鲁氏接合酵母的糖酵解途经中，被分解成丙酮酸。丙酮酸脱羧后可生成乙醇。鲁氏接合酵母能够通过生物合成途径或者氨基酸分解代谢途径，通过相应α-酮酸的脱羧作用形成高级醇[8]。鲁氏接合酵母还可以通过Ehrlich途径从不同枝链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等）合成相对应的芳香杂醇（异戊醇、活性戊醇、异丁醇等）。鲁氏接合酵母合成的 4-羟基-呋喃酮类香味物质有两种：一种是 HEMF[4-羟基-2（或5）-乙基-5（或2）-甲基-3（2H）-呋喃酮]和，另一种是HDMF[4-羟基-2,5 二甲基 -3（2H）-呋喃酮 ]。HEMF和HDMF 能提高酱油的鲜味和焦糖型风味[9]。

2.2 多变假丝酵母（Candida versatilis）

多变假丝酵母耐低水分活度、耐高盐、耐低渗透压和高离子浓度。其代谢产物中的酚类化合物（4-乙基愈创木酚和4-乙基酚），可以使酱油产生丁香香味和烟熏味。其生成原理是：炒小麦在微生物的作用下，生成阿魏酸和香豆酸，然后可通过多变假丝酵母转化成4-乙基愈疮木酚和4-乙基酚。而鲁氏接合酵母则不能进行这种转化[10，11]。

2.3 球拟酵母（Torulop-sis）

在酱醪中分离的球拟酵母主要有易变球拟酵母、埃契氏球拟酵母及蒙奇球拟酵母等。球拟酵母主要作用在发酵中后期。在发酵中后期，酱醪糖浓度和pH值均降低，鲁氏接合酵母开始自溶。此时球拟酵母代谢活跃。球拟酵母属于酯香型酵母，关系着酱油的呈香水平。球拟酵母代谢产生的主要呈香物质包括4-乙基苯酚、4-乙基愈创木酚、2-苯乙醇等。同时，在低pH的酱醪中，球拟酵母生成的酸性蛋白酶会对短肽进行进一步水解，进一步提高酱油的呈香呈鲜。但是，球拟酵母不能过量添加，否则会产生过量醋酸、烷基苯酚等强刺激的香味物质，导致酱醪香味恶化。

3 乳酸菌（Lactobacillus）

从酱油酱醪中分离出细菌有乳酸菌、芽孢杆菌等。细菌中对酱油发酵有帮助的主要是乳酸菌，其中包括四联球菌、植物乳杆菌、嗜盐片球菌等。而芽孢杆菌则会降低酱油原料利用率，还会大大败坏酱油的风味。

3.1 嗜盐片球菌（Pediococcus halophilus）

嗜盐片球菌最适生长温度30℃，最适生长pH值为5～6，在高盐分下能够生长良好。嗜盐片球菌在发酵前期生长繁殖，产生适量乳酸，降低酱醪pH，从而促进鲁氏接合酵母的生长。但当酱醪pH值＜5时，嗜盐片球菌停止繁殖。

3.2 四链球菌（Tetracoccussoyae）

四链球菌属于嗜盐性乳酸菌，可在20%盐分下生长良好。四链球菌主要在发酵后期活跃。其主要作用和嗜盐片球菌相似，也是产乳酸，降低酱醪pH。当酱醪pH值＜5时，四链球菌也停止繁殖。

3.3 植物乳杆菌（Lactobacillus pantarum）

植物乳杆菌最适盐度为8%～9%，最适生长温度为32～35℃。植物乳杆菌能够增加酱油香气，保证酱油采用高盐稀醪发酵工艺生产时能有更好的质量和香味[12]。

总而言之，酱油发酵是一个漫长复杂的过程。在不同的发酵阶段，各种微生物协同或抑制，产生一系列生化反应，最终决定了酱油的品质。因此研究酱油发酵微生物对于提高酱油品质很有必要。