桂花果皮醇提物的抑菌活性和抗氧化活性的研究

刘 刚, 伍佩珂, 蒋小妹, 汪淑芳, 张晓喻, 杨秋萍, 李学理, 吴凤兰

(1. 四川师范大学 生命科学学院, 四川 成都 610101；2. 四川师范大学 食品功能及加工应用研究所, 四川 成都 610101)

桂花(OsmanthusfragransLour.)是木犀科木犀属的小乔木[1]，原产我国西南部，主要分布于广西、湖南、贵州及福建等地区[2].中国南岭以北到秦岭以南的中亚热带和北亚热带(北纬24°～33°)，是桂花集中分布和栽培的地区[3].桂花花朵的营养价值高、民间习用历史久远，早在汉朝就已广泛应用于食品、香料、酒、茶等行业，研究也较多[4-5].桂花的果实可入药，有化痰、生津、暖胃、平肝的功效，其枝叶及根可煎汁敷患处，具有活筋骨、止疼痛的功效[6].有研究表明，桂花果皮作为未充分利用的副产物,含有多种功效成分[7-8].如蒽醌类化合物，其具有抑菌、抗肿瘤、止血等作用,含有的有机酸具有抗菌、利胆、升白等作用,其黄酮类化合物有抗菌、抗病毒、解痉挛等作用,桂花果皮中的黑色素还具有抗氧化活性[9].研究桂花果皮提取物的抗菌活性，具有重要意义.

金黄色葡萄球菌S.aureus是重要的条件致病菌[10]，属革兰氏阳性菌，它不仅易引发许多严重感染，而且还可产生具有较强细胞毒性的肠毒素.大肠杆菌E.coli是人类及各类温血动物肠道中的正常寄居菌，属于革兰氏阴性菌.大肠杆菌是国际上公认的卫生监测指示菌[11]，如果食品、饮水中检测出该菌，就意味着该食物可能直接或间接受到了粪便的污染[12].本实验研究以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为目标检测微生物，研究桂花果皮醇提物的抑菌活性，并进一步研究桂花果皮醇提物清除DPPH·和ABTS·的能力，从而评价其抗氧化活性.近年来，对桂花油脂类功能的研究较多[13-14]，但是，对桂花果皮醇提物的抑菌及抗氧化活性，目前尚未见文献报道.

1 材料和方法

1.1材料与文献[1]对照，在四川师范大学成龙校区采集的植物材料，鉴定为桂花(O.fragrans)，采集其果实后，去杂清洗，分离出种子与果皮.果皮置60 ℃干燥，粉碎，过20～40目筛，备用.桂花果皮醇提物的制备：称取桂花果皮25.00 g，按1∶20比例加入体积分数70%乙醇，60 ℃水浴回流提取1 h，重复2次，过滤，合并过滤液，浓缩至50 mL(以生药量计500 mg/mL)，冷藏备用.

1.2测试菌种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均由四川师范大学生命科学学院实验室提供.分别取出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌各0.1 mL，接种到20 mL牛肉膏蛋白胨琼脂固体培养基，37 ℃恒温培养24 h，挑选生长健壮的菌落，再接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基，培养24 h活化菌种，备用.参照文献 [15]的方法，制备菌悬液：分别取活化菌种各0.1 mL，置于20 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基，37 ℃恒温培养48 h.紫外可见分光光度计625 nm处测定OD值，加无菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基，调节菌悬液体积使其OD值在0.08～0.13，此时每毫升菌悬液的活菌数(CFU，培养单位)即为108CFU/mL.测定时，再加适量无菌牛肉膏蛋白胨液体培养基，使菌悬液的活菌数稀释到105CFU/mL.

1.3仪器R-1005型旋转蒸发仪，上海予华仪器设备有限公司；SHB-B95型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；HH.W21型恒温水浴锅，北京中兴伟业仪器有限公司；LDZX-50KB型立体压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；ESJ205-4型电子分析天平，沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱、DHP-9082型电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-2F型超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；DHG-9240型电热鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；UV-2600型紫外可见分光光度计，日本岛津科学仪器公司.

1.4试剂牛肉膏蛋白胨培养基(杭州微生物试剂有限公司),乙醇、甲醇、DPPH、ABTS(成都市长征化玻有限公司),其余试剂为分析纯.

1.5桂花果皮醇提物的抑菌活性

1.5.1滤纸片扩散法 参照文献[16]方法，根据有无抑菌圈、抑菌圈直径判定提取物的抑菌活性.用打孔器制备5 mm滤纸圆片，灭菌后烘干.分别将10 μL一定质量浓度桂花皮醇提取物滴在各滤纸圆片上，以体积分数75%乙醇为阳性对照，以蒸馏水为空白对照.分别移取0.1 mL菌悬液，用灭菌的涂布棒均匀涂布到牛肉膏蛋白胨琼脂固体培养基，用无菌镊子夹取各处理过的滤纸片，置于培养基上，每皿贴4张.37 ℃培养24 h，测定抑菌圈直径，重复3次.

1.5.2比浊法 参照文献[17]方法，测定醇提物的抑菌活性.以体积分数75%乙醇为阳性对照，以只加0.10 mL菌悬液、4.90 mL培养基为空白对照.将桂花皮醇提物稀释成不同的浓度，分别吸取0.10 mL加入装有4.8 mL无菌液体培养基的一系列试管，再加入0.10 mL菌悬液，塞上棉塞，震荡混匀.在37 ℃条件培养24 h.用液体培养基调零，600 nm处测定各个试管的OD值，重复3次.

1.5.3测定最小抑菌浓度(MIC) 参照文献[18]方法，采用试管2倍稀释法测定醇提物的最小抑菌质量浓度.取2组各9支无菌试管，每管各加2.00 mL灭菌培养基，先在第1支试管中加桂花皮醇提物2.00 mL，混匀后吸出2.00 mL置于第2支试管，混匀后再吸取2.00 mL至第3支试管，如此连续稀释至第7管，混匀后弃去2.00 mL；第8支试管不加提取物，作为空白对照；第9支试管不加细菌只加提取物2.00 mL，混匀后弃去2.00 mL，观察提取物是否有污染.第二组的1～7支试管，分别加入0.1 mL的105CFU/mL大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的菌悬液，混匀，37 ℃培养24 h，观察结果.与第8、9支试管比较，第1～7支试管中不发生混浊变化的最高提取物稀释倍数的浓度，即为MIC值，重复测定3次.

1.6桂花果皮醇提物的抗氧化活性参照文献[19-20]方法，分别测定桂花果皮醇提物清除DPPH·和ABTS·的能力，评价其抗氧化活性.

1.6.1清除DPPH·的活性 分别取质量浓度25、50、100、125、200、250 mg/mL的醇提取溶液各200 μL置于试管，各加3.8 mL质量浓度为80 mg/L的甲醇-DPPH溶液，混匀，避光1 h，515 nm处测得样品吸光度值(Ai).以不加样品，加体积分数70%乙醇的甲醇-DPPH溶液为空白，测得空白吸光度值(A0)；以无甲醇-DPPH溶液为对照，测得对照吸光度值(Aj).以3.8 mL甲醇加200 μL的体积分数70%乙醇为调零溶液，实验重复3次.按公式计算清除率：

DPPH·清除率(%)=

[1-(Ai-Aj)/A0]×100%，

Ai为样品吸光度值；Aj为对照吸光度值；A0为空白吸光度值.

1.6.2清除ABTS·的活性 先将ABTS溶液与过硫酸钾溶液等体积混合，置暗处12 h，再用甲醇稀释，直到在734 nm处吸光度值达到0.688～0.702，即得ABTS·溶液.分别取不同质量浓度样品200 μL，各加入3.8 mL的ABTS·溶液，静置1 min，在734 nm处测得样品吸光度值(Ai)；再取3.8 mL 的ABTS·溶液与适量体积的体积分数70%乙醇，混合后测得空白吸光度值(A0).200 μL的体积分数70%乙醇和3.8 mL蒸馏水混合，作为调零空白液.实验重复3次，按公式计算清除率：

ABTS·清除率(%)=(1-Ai/A0)×100%,

其中,Ai为样品吸光度值，A0为空白吸光度值.

1.7统计与分析用SPSS 17.0软件进行方差分析，多重比较用LSD法[21]，结果以means±std表示.

2 结果与分析

2.1滤纸片扩散法测定的抑菌活性采用滤纸片扩散法，在牛肉膏固体培养基，分别测定桂花果皮醇提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性，结果见表1.

从表1可知，与无菌水空白比较，桂花果皮醇提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌都有一定的抑制作用，差异极显著(P<0.01)，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈(8.98±0.413) mm，抑菌效果为低敏，而对大肠杆菌的抑菌圈(10.09±0.605) mm，抑菌效果为中敏.而与体积分数75%的乙醇比较，桂花果皮醇提物对这两种菌的抑菌效果均有显著或极显著的差异.桂花果皮醇提物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈(8.98±0.413) mm较体积分数75%乙醇的抑菌圈(6.37±0.187) mm大，而对大肠杆菌的抑菌圈为(10.09±0.605) mm也较体积分数75%乙醇的抑菌圈(6.67±0.255) mm更大.

表1 桂花果皮醇提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性(n=3)

注：“-”抑菌圈直径小于6 mm，判定无抑菌效果；“+”抑菌圈直径6～10 mm，为低敏；“++”抑制圈直径，为中敏.与无菌水比较，**P<0.01，差异极显著；与体积分数75%乙醇比较，#P≤0.05，差异显著；##P<0.01，差异极显著.

无菌水空白对照的抑菌圈为0.00 mm，表明无外来污染的影响，无菌操作可控，实验准确可信.设体积分数75%乙醇的对照，其对大肠杆菌的抑菌圈为(6.67±0.255) mm，而对金黄色葡萄球菌的抑菌圈(6.37±0.187) mm，说明体积分数75%乙醇对两类供试细菌均具有一定的抑菌效果.试验结果表明：与体积分数75%乙醇比较，桂花果皮醇提物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈较大(8.98±0.413) mm，差异性达到显著(P≤0.05)，而对大肠杆菌的抑菌圈更大(10.09±0.605) mm，差异极显著(P<0.01).对G+和G-菌的抑制作用，桂花果皮醇提物的效果明显高于体积分数75%的乙醇.

2.2比浊法测定的抑菌活性采用比浊法，测定桂花果皮醇提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌作用，结果见表2.

从表2可知，桂花果皮醇提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果均极显著(P<0.01)，且随桂花果皮醇提物质量浓度的增加，抑菌效果增强.与体积分数75%乙醇比较，桂花果皮醇提物有极显著的差异性(P<0.01)，体积分数75%乙醇对大肠杆菌的抑菌率为2.55%，最低质量浓度125 mg/mL的桂花果皮醇提物的抑菌率达20.94%；而对金黄色葡萄球菌，体积分数75%乙醇的抑菌率为2.23%，最低质量浓度125 mg/mL桂花果皮醇提物的抑菌率达19.14%.因此，最低质量浓度125 mg/mL的桂花果皮醇提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制率，明显高于体积分数75%乙醇.桂花果皮醇提物质量浓度500 mg/mL时对大肠杆菌的抑菌率达到91.66%，而对金黄色葡萄球菌的抑菌率91.39%，桂花果皮醇提物对两类细菌的抑制率均大于90%.

表2 桂花果皮醇提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制率(n=3)

注：与空白对照比较，**P<0.01，差异极显著；与乙醇比较##P<0.01，差异极显著.

2.3桂花果皮醇提物的最低抑菌质量浓度(MIC) 采用试管二倍稀释法，测定桂花果皮醇提物的MIC值，结果见表3.

表3 桂花果皮醇提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)(n=3)

注：“-”表示溶液清澈，无菌生长；“+”表示有少量细菌生长;“++”表示有较多细菌生长；“+++”表示溶液混浊，细菌正常生长，无抑菌效果.

结果表明：桂花果皮醇提物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌质量浓度为62.5 mg/mL，对大肠杆菌的最低抑菌质量浓度为125 mg/mL.结果提示，桂花果皮醇提物对G+菌的MIC值比对G-的MIC值小，可能对两类细菌的抑制作用机理有差异.

2.4桂花果皮醇提物对DPPH·的清除活性用DPPH法测定桂花果皮醇提物清除自由基的能力，评价其抗氧化活性，结果见图1.

桂花果皮醇提物质量浓度(以生药计)(mg/mL)

从图1中，桂花果皮醇提物对DPPH·有明显的清除能力，随其质量浓度的增加，清除DPPH·的活性增强，表现出明显的量效关系.桂花果皮醇提物质量浓度大于100 mg/mL，其清除DPPH·的活性达90%以上，趋于平缓.

在测定条件下，桂花果皮醇提物质量浓度与自由基清除率的拟合曲线方程为

y=27.215ln(x)-31.151，R2=0.938 2，

桂花果皮醇提物对DPPH·的IC50值为19.145 mg/mL.

2.5桂花果皮醇提物对ABTS·的清除活性用ABTS法测定桂花果皮醇提物清除自由基的能力，从而评价其抗氧化活性，结果见图2.

桂花果皮醇提物质量浓度(以生药计)/(mg/mL)

从图2可以看出：桂花果皮醇提物对ABTS·的清除能力显著，随其质量浓度的增加，对ABTS·的清除率明显增强，表现出明显的量效关系.当醇提物质量浓度达到50 mg/mL时，清除率高达95%，随后质量浓度再增加，对ABTS·的清除率趋于平缓.

在测定条件下，桂花果皮醇提物质量浓度与其ABTS·清除率的拟合曲线方程为

y=7.727 5ln(x)-62.87，R2=0.955 3，桂花果皮醇提物对ABTS·的IC50值为4.624 mg/mL.

从桂花果皮醇提物清除DPPH·和ABTS·的清除率、IC50值来看，抗氧化活性都很高，而且都表现出明显的量效关系.

3 结论

桂花果皮用体积分数70%乙醇作为溶剂，制备得到醇提物，测定该醇提物的抑菌活性、抗氧化活性，为进一步研究桂花果皮的抑菌成分、抑菌机理等研究奠定了一定的基础.

革兰氏阴性的大肠杆菌、革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌是常见的食源性条件致病菌[22]，以抑菌圈、MIC为评价指标，采用滤纸片扩散法、比浊法和试管二倍稀释法，测定桂花果皮醇提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制效果.滤纸片扩散法的结果表明，桂花果皮醇提物对G+和G-两类细菌的抑菌效果，均达到显著或极显著；比浊法的结果表明，质量浓度500 mg/mL的桂花果皮醇提物，对G+和G-两类细菌的抑制率都达到90%以上.桂花果皮醇提物对大肠杆菌的MIC值为125 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC值为62.5 mg/mL.因此，桂花果皮醇提物具有显著的抑菌活性.桂花果皮醇提物清除DPPH·的IC50值为 19.145 mg/mL，而清除ABTS·的IC50值为4.624 mg/mL，且都表现出明显的量效关系，此结果表明，桂花果皮醇提物有明显的抗氧化活性.

综上所述，桂花果皮的醇提物具有一定的抑菌和抗氧化活性，作为未利用的植物副产物，桂花果皮有望开发成防腐剂或抗氧化剂，以期为桂花资源的高效利用提供理论参考.

致谢四川师范大学大精设备项目(DJ2016-08)、食品与药品制造检验综合应用的实践、生物技术应用型人才培养综合改革研究与实践、四川师范大学创新创业训练计划项目(201610636120)对本文给予了资助，谨致谢意.