干旱胁迫对金银花叶片叶绿素含量及荧光特性的影响

马雪梅， 吴朝峰

(河南安阳工学院，河南安阳 455000

金银花为忍冬科植物忍冬(Lonicerajaponica)的干燥花蕾，是我国常用中药材，具有抗菌、抗病毒、清热解毒、保肝利胆之功效，主要分布在我国山东、河南、河北、湖北等省。河南省金银花大多种植于丘陵地区或山区，水分短缺成为影响金银花生长发育及产量、品质的主要因素之一。

叶绿素是植物光合作用中的重要色素。在干旱胁迫下，植物叶片的片层结构会受到破坏，叶绿素发生分解而导致含量降低、叶片发黄，在一定范围内，叶绿素含量的高低会直接影响叶片的光合作用，进而影响植物抗旱性的强弱[1-2]。叶绿素荧光技术在测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、转换、耗散、分配等方面具有独特的作用，是探测分析植物光合功能、研究植物光合生理与逆境胁迫关系的一个重要手段[3]。本试验通过研究干旱胁迫对河南省金银花叶片叶绿素含量变化及荧光特性的影响，了解干旱胁迫对金银花叶片光合作用的影响机制，为河南省金银花抗旱特性的鉴定、耐旱性较强品种的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试金银花品种为金丰一号、大毛花、密银花，分别来自河南省封丘县、安阳市、新密市。

1.2 试验处理

2014年3月下旬，选择长势良好、大小基本一致的金银花扦插苗，移栽到基质相同、直径为25 cm、深为30 cm的花盆内，每盆1株，正常管理1年。2015年7月27日傍晚浇透水，次日开始分别进行轻度干旱胁迫(LS)、中度干旱胁迫(MS)、重度干旱胁迫(SS)3种不同干旱胁迫处理，土壤相对含水量分别为田间持水量的70%～75%、40%～45%、20%～25%，以土壤相对含水量为田间持水量的85%～90%为对照(CK)。每处理5盆，重复3次。采用称重法测定土壤水分含量，胁迫处理2d后进行常规的水分管理，保证植株生长旺盛。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 叶绿素含量 将胁迫处理15 d后的新鲜叶片洗净，擦干，快速剪成直径约为5 mm的碎片，分成3份；每份称取 0.2 g，放入25 mL具塞刻度试管中，加入95%乙醇溶液 10 mL，密封，置于暗处浸泡2 d待叶片全部变白；将色素提取液倒入1 cm光径的比色杯内，以95%乙醇溶液为空白，紫外分光光度计分别测定波长为663、645 nm的吸光度(D值)，计算叶片叶绿素a含量(Ca)、叶绿素b含量(Cb)、叶绿素总含量(Ct)，单位为mg/g，计算公式分别为：Ca=(12.70D663 nm-2.59D645 nm)×V/(WF×1 000)；Cb=(22.90D645 nm-4.67D663 nm)×V/(WF×1 000)；Ct=Ca+Cb=(22.20D645 nm+8.02D663 nm)×V/(WF×1 000)。式中，D663 nm、D645 nm分别为波长663、645 nm处的吸光度；V为提取液的总体积，mL；WF为样品鲜质量，g。

1.3.2 叶绿素荧光参数 于干旱胁迫处理周期结束当天08：00—10：00，采用德国WALZ产PAM-2100型便携式调制叶绿素荧光仪测定金银花叶片的荧光参数。测定时，将叶片暗适应20 min，照射测量光小于0.5 μmol/(m2·s)时测初始荧光(Fo)，照射饱和脉冲为2 800 μmol/(m2·s)时测定最大荧光(Fm)；打开光照度为600 μmol/(m2·s)的内源光化光持续5 min，测定光适应下的稳定态荧光(Ft)，隔20 s打开饱和脉冲测定光适应下的最大荧光(Fm′)。根据测定的参数计算光系统Ⅱ(PSⅡ)的潜在光化学效率(Fv/Fo)、PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ光化学量子产量(Y)、表观光合电子传递速率(ETR)、光化学猝灭系数(qP)、非光化学猝灭系数(qN)，计算公式分别为：

Fv/Fo=(Fm-Fo)/Fo；

Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm；

Y=(Fm′-Ft)/Fm′；

ETR=Y×PAR×0.50×0.84；

qP=(Fm′-Ft)/(Fm′-Fo)；

qN=(Fm-Fm′)/(Fm-Fo)。

式中，PAR为光合有效辐射。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对叶绿素含量的影响

叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，叶绿素a(Chla)含量越高；在胁迫下有利于保持较高的光合强度，叶绿素b(Chlb)含量越大，表明其在胁迫下降解速度缓慢；叶绿素a与叶绿素b的比值(Chla/b)可反映出叶绿素a、叶绿素b对胁迫的敏感性及胁迫对二者的伤害程度。由图1、图2、图3可知，随干旱胁迫程度加剧，3种金银花叶片的叶绿素a、叶绿素b及叶绿素总量呈现明显的下降趋势，叶绿素b含量微小变化。说明干旱胁迫引起叶绿素a含量显著下降，从而导致叶绿素总量下降。整个处理过程，金丰一号叶绿素a含量、叶绿素b含量以及叶绿素总量都最高，其次是密银花，大毛花最低。经SS处理后，3种金银花叶片叶绿素总量降幅大小依次为：大毛花(48.5%)>密银花(42.3%)>金丰一号(34.3%)，说明3种金银花抗旱能力的大小为：金丰一号>密银花>大毛花。图4表明，干旱胁迫程度加剧，叶绿素(a/b)值呈现先升后降，在SS处理下，叶绿素(a/b)下降幅度数值大小顺序为大毛花(51.6%)>密银花(44.1%)>金丰一号(33.5%)。说明随着干旱胁迫程度的加剧，叶绿素合成受阻，分解速率增大，叶绿素含量下降。

2.2 干旱胁迫对3种金银花叶绿素荧光动力学参数的影响

2.2.1 对初始荧光(Fo)和最大荧光(Fm)的影响 初始荧光(Fo)表示叶片PSⅡ反应中心处于完全开放时的荧光水平，Fo上升表明PSⅡ反应中心被破坏或可逆失活[4-5]。由图5可知，3种金银花叶片Fo均随胁迫程度加剧呈现出上升的趋势，与CK相比，经LS处理，3种金银花叶片Fo增幅不明显，在MS下，Fo增幅有了一定的变化，而在SS下，金丰一号、大毛花和密银花叶片Fo比CK分别高12.0%、14.3%和13.1%，表明PSⅡ反应中心破坏程度加剧。

最大荧光(Fm)是PSⅡ反应中心处于完全关闭时的荧光产量，其数值降低可作为光抑制的一个特征[6]。由图6可知，3种金银花均表现出胁迫程度加剧、叶片Fm明显下降的特性。与CK相比，在LS、MS下，Fm降幅不明显，重度干旱胁迫下，Fm明显下降，其中金丰一号叶片Fm降低了23.1%，大毛花降低了26.4%，密银花降低了24.5%。

2.2.2 潜在光化学效率(Fv/Fo)和最大光化学效率(Fv/Fm) 可变荧光Fv反映PSⅡ原初电子受体QA的还原情况，代表PSⅡ光化学活性的大小[7]。Fv/Fo和Fv/Fm是研究叶绿素荧光的2个重要参数，分别代表PSⅡ的潜在活性和原初光能转化效率。图7、图8表明，3种金银花叶片Fv/Fm和Fv/Fo均呈现出随胁迫程度加剧下降幅度增加的特点，说明干旱胁迫使PSⅡ潜在活性中心受损，进而影响到植物光合作用的原初反应，光合电子传递过程受到影响，而光化学效率的高低直接决定叶片光合作用的高低。与CK相比，3种金银花叶片Fv/Fo下降显著，且在SS下，金丰一号、大毛花和密银花Fv/Fo值比CK分别下降了38%、43.5%和40.4%。表明重度干旱胁迫使金银花3个品种受到较大程度的伤害。由图8可知，正常供水情况下，3种金银花叶片Fv/Fm在0.80以上。且随干旱胁迫程度加剧，Fv/Fm明显下降。与CK相比，金丰一号、大毛花和密银花Fv/Fm值分别下降了9.66%、12.3%和10.9%，最大光化学效率顺序为金丰一号>密银花 >大毛花。表明大毛花光合作用受干旱胁迫影响较大。

2.2.3 光化学量子产量(Y)和表观光合电子传递速率(ETR) 光化学量子产量用来表示植物光合作用电子传递的量子产额，可作为植物光合电子传递速率快慢的相对指标[8]。表观光合电子传递速率反映实际光强条件下的表观电子传递效率。从图9、图10可知，3个金银花品种的Y和ETR均随着胁迫程度加剧呈现出下降趋势。与CK相比，金丰一号、密银花和大毛花Y值分别降低了48.4%、54.1%和50.4%，而ETR下降了40.7%、54.7%和45.9%。其中金丰一号下降幅度最小，大毛花下降幅度最大。说明干旱胁迫对大毛花光合电子传递过程破坏较大，而对金丰一号破坏较轻，进而表明金丰一号适应干旱环境的能力较强，表现出较好的抗旱性。

2.2.4 干旱胁迫对光化学淬灭系数和非光化学猝灭系数的影响

2.2.4.1 光化学淬灭系数(qP) 荧光猝灭是植物体内光合量子效率调节的一个重要方面，它分为光化学淬灭系数(qP)和非光化学淬灭系数(qN)，qP越大，表示光能中转化为活泼化学能的能量越多，植物对光能的利用效率也越高[9]。同时说明PSⅡ的电子传递活性和反应中心开放部分的比例越高[10-11]。图11表明，3种金银花叶片qP均随着干旱胁迫程度的增加而呈现出下降的趋势。在LS下，金丰一号、大毛花、密银花qP降幅分别为5.38%、9.89%和7.37%，差异不显著，说明金银花在轻度干旱胁迫时，qP受到的影响较小，PSⅡ仍能维持较高的光合电子传递活性。在SS下，与CK相比，金丰一号、大毛花和密银花金银花qP降幅明显，分别下降25.8%、36.3%和32.6%，表明SS下，大毛花PSⅡ的电子传递活性受到抑制。总之，金丰一号抗旱性较强，密银花抗旱性居中，大毛花抗旱性弱。

2.2.4.2 非光化学猝灭系数(qN) 化学淬灭系数(qN)反映PSⅡ反应中心天线色素吸收的光能不能用于光合电子传递而以热的形式耗散掉的光能部分[12]。qN是一种自我保护机制，PSⅡ通过提高非辐射性热耗散来消耗其吸收的过量的光能，从而保护自己免受因天线色素吸收过多光能而引起光合器官破坏或损伤，对保护器官起一定的作用。由图12可知，随着干旱胁迫程度的增加，3种金银花叶片qN值均呈现出逐渐上升的趋势，说明在干旱胁迫下，金银花各品种PSⅡ反应中心潜在热耗散能力增强，从而避免因PSⅡ吸收过量光能而引起光合器官损伤。在LS和MS下，3种金银花叶片qN增加幅度均较小，重度干旱胁迫时，3种金银花品种的qN显著增大，且与CK相比，金丰一号、大毛花和密银花的qN值分别上升了44.6%、19.4%和30.2%，表明金丰一号通过提高qN及时耗散过剩的光能，有效保护了光合器官免受破坏。

3 小结

叶绿素a、叶绿素b分子含量多少及降低幅度大小、Chla/b的比值大小可反映出叶绿素a和叶绿素b对胁迫的敏感性及胁迫对叶绿素的伤害程度。试验表明，金丰一号叶绿素a含量、叶绿素b含量以及叶绿素总量都最高，叶绿素a/b下降幅度最小。说明金丰一号的抗旱性优于其他金银花品种。

Fo、Fv、Fv/Fm和Y等荧光参数的变化程度可用来鉴别植物抵抗或忍耐干旱的能力[13-14]。本研究表明，正常供水条件下，3个金银花品种的Fo有一定的差异，Fm、Fv、Fv/Fo、Yield、qP、ETR等荧光参数差异较小。说明正常供水条件下，3个金银花品种叶片的PSⅡ反应中心的开放程度有所不同。水分胁迫下，3个金银花品种的荧光参数都发生变化，以重度干旱胁迫为例，金丰一号叶片的Fv/Fm、Fv/Fo、Y、qP、qN、ETR等各个荧光参数的平均值均高于其他2种金银花，而Fo低于其他品种；从荧光参数在干旱胁迫下的变化幅度看，与其他2种金银花品种相比，金丰一号Fv/Fm、Fv/Fo、qP、Y、ETR下降幅度最小，但金丰一号叶片Fo增加幅度最小、qN增加幅度最大。说明干旱胁迫下金丰一号PSⅡ反应中心的胁迫耐性较强，叶片的光化学效率较高，因此，金丰一号具有较强的抗旱性。