MTSase和MTHase在Brevibacillus brevis中的克隆表达及应用研究

吴世雄 ， 宿玲恰 ， 姚锴琳 ， 吴 敬 ， 吴 丹 *

（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；2.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122）

麦芽寡糖基海藻糖合成酶（maltooligosyl trehalose synthase，MTSase，EC5.4.99.15）和麦芽寡糖基海藻糖水解 酶 （maltooligosyltrehalose trehalohydrolase ，MTHase，EC3.2.1.141）分别由基因treY和treZ编码，是双酶法生产海藻糖的关键酶[1-4]。在用麦芽寡糖或直链淀粉合成海藻糖的过程中，MTSase首先作用于底物还原性末端的Cl-OH，产生α-1，4-糖苷键到 α，α-1，1-糖苷键的分子内转糖基作用，形成中间产物麦芽寡糖基海藻糖；MTHase则专一地内切该中间产物中麦芽寡糖基与海藻糖相连的 α-1，4-糖苷键，释放出海藻糖[5]。

海藻糖是一种非还原性二糖，广泛存在于自然界中，多种生物体内都含有该糖[6-7]。海藻糖通过保护生物膜和蛋白质等大分子不被变性失活，来维持生命体的生物特征和生命过程[8-9]。外源性的海藻糖对蛋白质、生物膜等大分子同样具有良好的保护作用，使得海藻糖可作为生物以及医学领域的活性大分子的保护剂，代替血浆蛋白作为蛋白质、疫苗药物等生物活性物质的稳定剂[10-15]。同时海藻糖的功能特性在食品加工领域也具有优越表现，如对酸和热的高度稳定性、抑制脂肪酸败等[6-7]。正是因为海藻糖具有特殊的理化性质和功能，因此被广泛用于医药业、食品、化妆品等行业。

海藻糖的制备方法主要有天然生物提取法[16]、化学合成法[6]、微生物发酵法[17]、基因工程法[18]和酶转化法[19]，而酶转化法以其低成本和高转化率的特点成为目前制备海藻糖的主要方法[20]。酶转化法又分为磷酸化酶法、海藻糖合成酶法、麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶双酶法[21]。

本研究首次将（Sulfolobus acidocaldarius）ATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶在Brevibacillus brevis中进行了克隆表达，在此基础上探究了双酶法制备海藻糖的工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 菌株E.coli JM109和Brevibacillus brevis由本实验室保藏；质粒pSVN、pET-24a（+）-treY 和 pET-24a（+）-treZ 由本实验室保藏。

1.1.2 酶及主要试剂 EcoR I、Hind III限制性内切酶，T4 DNA ligase，PrimerStar Taq DNA 聚合酶，dNTPs，新霉素均购自上海宝生物；DNA纯化试剂盒购自上海生工；普鲁兰酶、CGTase为本实验室所有；蛋白胨、酵母粉、多聚蛋白胨、牛肉浸膏购自Oxiod（英国）公司；其他试剂均为国产分析纯，购自国药集团。

1.1.3 培养基 SOB培养基（g/L）：蛋白胨20.0，酵母 粉 5.0，MgCl2·6H2O 2.0，NaCl 0.5，KCl 0.19，pH 7.0。

LB 培养基（g/L）：蛋白胨 10.0，酵母粉 5.0，NaCl 10.0，pH 7.0（固体培养基加 1.5%～2.0%的琼脂粉）。

TM液体培养基（g/L）：多聚蛋白胨10.0，牛肉粉5.0，酵母粉2.0，无水葡萄糖10.0，微量元素液10 mL，pH 7.2。

TM固体培养基（g/L）：多聚蛋白胨10.0，牛肉浸膏5.0，酵母粉2.0，无水葡萄糖 10.0，微量元素液10 mL，MgCl2·6H2O 4.1，琼脂粉 20.0，pH 7.2。

微 量 元 素 液 （g/L）：FeSO4·7H2O 10.0，ZnSO4·7H2O 5.25，CuSO4·5H2O 3.0，MnSO4·4H2O 0.5，Na2B4O7·10H2O 0.23，CaCl22.0，（NH4）6Mo7O240.1。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 按照treY和treZ基因序列，按照引物设计原则用引物设计软件DNAMAN设计了以下引物（下划线部分分别为EcoR I和Hind III酶切位点）。

treY（EcoR I、Hind III）

F1： 5′-CGGAATTCATGATTAGCGCGACCTAT CG-3′28 bp

R1： 5′-CCAAGCTTACATACGCACCAGGATA C-3′26 bp

treZ（EcoR I、Hind III）

F2： 5′-CGGAATTCATGTTTAGCTTTGGCGGC AA-3′28 bp

R2： 5′-CCAAGCTTATTCCAGTTGATACACG C-3′26 bp

1.2.2 PCR获得treZ基因片段 分别以pET-24a（+）-treY 和 pET-24a（+）-treZ 为模板，F1/F2、R1/R2为正反向引物扩增treY和treZ基因片段。PCR参数：94℃ 预变性 4 min；进入 PCR循环：98℃ 变性10 s，55 ℃ 退火 5 s，72 ℃延伸 2 min 20 s或 2 min，30个循环；最后72℃10 min，4℃ 保温。

1.2.3 目的基因的克隆及鉴定 将1.2.2节所得到的基因片段与经EcoR I和Hind III酶切纯化后的载体pSVN，用 T4 DNA ligase 4℃ 连接 16 h。连接产物转化克隆宿主E.coli JM109涂布LB固体培养基 （含10 μg/mL新霉素），30℃ 培养箱培养 10 h，挑取单菌落，经LB液体培养基（含10 μg/mL新霉素）30℃ 培养8 h后，收集菌体抽提质粒，送测序公司测序。测序正确的质粒电转化表达宿主Brevibacillus brevis，涂布TM 固体培养基（含10 μg/mL新霉素），30℃ 培养箱培养12 h，挑取单菌落，经TM液体培养基（含10 μg/mL新霉素）30℃ 培养10 h后保甘油菌。

1.2.4 重组菌的摇瓶发酵及重组蛋白的SDSPAGE分析

（1）重组菌的摇瓶发酵：分别取 20 μL甘油管保存的重组菌Brevibacillus brevis/pSVN-treY和Brevibacillus brevis/pSVN-treZ接种于 10 mL TM液体培养基（含 10 μg/mL 新霉素）中，30 ℃，200 r/min振荡培养过夜，取0.5 mL培养液转接到 50 mL TM 液体培养基 （含10 μg/mL新霉素）中30℃，200 r/min振荡培养48 h。发酵结束后，8 000 r/min离心15 min收集菌体。

（2）高压匀浆破碎细胞：将菌体沉淀中加入一定量的 20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶液重悬菌体，用高压匀浆细胞破碎仪破碎细胞，8 000 r/min离心 15 min，收集上清液。

（3）重组蛋白的SDS-PAGE分析：细胞破壁上清液经SDS-PAGE分析。

1.2.5 重组蛋白酶活力测定 将麦芽五糖溶解于20 mmol/L pH 6.0的磷酸-柠檬酸缓冲液中，配成1%的麦芽五糖溶液，取0.49 mL该溶液，加入10 μL MTSase粗酶液，60℃ 反应2 h，100℃沸水中煮10 min 终止反应，DNS 法[2，22]测酶活。 MTSase 的酶活单位定义为每1 min水解1 μmol麦芽五糖生成麦芽三糖基海藻糖所需的酶量[2]。

将麦芽五糖溶解于20 mmol/L pH 6.0的磷酸-柠檬酸缓冲液中，配成1%的麦芽五糖溶液，取0.48 mL该溶液，加入10 μL浓缩的MTSase酶液，60℃ 反应2 h，100℃沸水中煮10 min终止反应，得到麦芽三糖基海藻糖的水溶液，待溶液冷却后，加入 10 μL MTHase粗酶液，60℃ 反应 10 min，100℃沸水中煮 10 min终止反应，DNS法[2，22]测酶活。MTHase的酶活单位定义为每1 min水解麦芽三糖基海藻糖生成1 μmol海藻糖所需的酶量[2]。

1.2.6 双酶法制备海藻糖的条件优化 本研究以马铃薯淀粉为底物，经液化处理后于恒温水浴摇床进行酶转化实验。

（1）普鲁兰酶对海藻糖制备的影响。用质量浓度为200 g/L马铃薯淀粉经液化，加入MTSase 80 U/g淀粉和MTHase 20 U/g淀粉，分别加入5 U/g淀粉的普鲁兰酶和不加普鲁兰酶，pH 5.5，60℃恒温水浴摇床，150 r/min，反应48 h。HPLC检测酶转化产物。

（2）MTSase和MTHase加酶量对海藻糖制备的影响。用质量浓度为200 g/L马铃薯淀粉经液化，分别加入①MTSase 40 U/g 淀粉、MTHase 10、20、40、60 U/g淀粉；②MTSase 60 U/g淀粉、MTHase 10、20、40、60 U/g 淀粉；③MTSase 80 U/g 淀粉、MTHase 10、20、40、60 U/g 淀粉； ④MTSase 100 U/g 淀粉、MTHase 10、20、40、60 U/g 淀粉；加入普鲁兰酶 5 U/g淀粉，pH 5.5，55℃恒温水浴摇床，150 r/min，反应48 h。HPLC检测酶转化产物。

（3）温度对海藻糖制备的影响。用质量浓度为200 g/L马铃薯淀粉经液化，加入MTSase 80 U/g淀粉，MTHase 20 U/g淀粉，普鲁兰酶5 U/g淀粉，pH 5.5，50、55、60、65 ℃恒温水浴摇床，150 r/min， 反应48 h。HPLC检测酶转化产物。

（4）pH对海藻糖制备的影响。用质量浓度为200 g/L马铃薯淀粉经液化，加入MTSase 80 U/g淀粉，MTHase 20 U/g淀粉，普鲁兰酶5 U/g淀粉，pH 5.0、5.5、6.0 ，60 ℃恒温水浴摇床，150 r/min， 反应48 h。HPLC检测酶转化产物。

（5）底物浓度对海藻糖制备的影响。用质量浓度为 100、150、200、250、300 g/L 马铃薯淀粉经液化，加入MTSase 80 U/g淀粉，MTHase 20 U/g淀粉，普鲁兰酶5 U/g淀粉，pH 5.5，60℃恒温水浴摇床，150 r/min，反应48 h。HPLC检测酶转化产物。

（6）环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）对海藻糖制备的影响。用质量浓度为200 g/L马铃薯淀粉经液化，加入MTSase 80 U/g淀粉，MTHase 20 U/g淀粉，普鲁兰酶 5 U/g淀粉，分别在 0、12、24 h加入15 U/g淀粉的 CGTase和不加 CGTase，pH 5.5，60℃恒温水浴摇床，150 r/min，反应48 h。HPLC检测酶转化产物。

1.2.7 酶转化产物的检测 用HPLC检测酶转化产物。 HPLC 检测条件为：流动相（乙腈∶水=80∶20），流 速 ：0.8 mL/min， 柱 温 40 ℃ ，NH2柱 （APS-2 HYPERSIL，Thermo Scientific），示差折光检测器[23]。

2 结果与讨论

2.1 目的基因的扩增

以 pET-24a（+）-treY 和 pET-24a（+）-treZ 为模板，扩增treY、treZ基因片段，PCR产物用 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段大小分别约为2 200 bp和1 700 bp，与理论值一致。

2.2 重组表达质粒的构建

PCR扩增的treY、treZ基因片段分别与表达载体pSVN连接。连接产物转化克隆宿主 E.coli JM109，LB固体培养基培养，挑取单菌落，经LB液体培养基培养8 h后，收集菌体抽提质粒，送测序公司测序，测序结果完全正确，重组表达质粒构建完成。重组表达质粒电转化表达宿主Brevibacillus brevis构建重组菌。

2.3 重组菌的摇瓶发酵

重组菌经摇瓶30℃发酵，用高压匀浆破碎菌体，上清液通过 15%分离胶进行 SDS-PAGE分析，结果如图 1和图2所示，在MTSase和MTHase理论分子量附近出现明显的可溶性蛋白条带。酶活测定结果显示重组菌胞内酶活力分别达到MTSase 630.0 U/g（wet cell）、MTHase 170.0 U/g（wet cell），明显高于 NakaDa等[3-4]报道的 MTSase 1.2 U/g（wet cell）和 MTHase 3.4 U/g（wet cell）。

图1 重组MTSase蛋白电泳分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant MTSase

图2 重组MTHase蛋白电泳分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant MTHase

2.4 双酶法制备海藻糖的条件优化

2.4.1 普鲁兰酶对海藻糖制备的影响 马铃薯淀粉含大量支链淀粉，然而MTHase和MTSase均不能作用于支链淀粉中的α-1，6-糖苷键，导致底物利用率降低。普鲁兰酶可水解α-1，6-糖苷键，从而产生包含α-1，4-糖苷键的直连多聚糖[24]。因此，本研究首先探究了添加普鲁兰酶复配对制备海藻糖的影响。结果如图3所示，添加普鲁兰酶后海藻糖转化率为74.2%，而不添加普鲁兰酶的海藻糖转化率仅为46.4%，并且研究还发现在添加普鲁兰酶的一组中，除目的产物海藻糖、副产物葡萄糖和麦芽糖之外，麦芽三糖、四糖等其他组分比例较高，为38.6%，而添加普鲁兰酶时该组分含量明显下降，仅为10.0%。因此，添加普鲁兰酶能够有效改善底物利用率，从而提高海藻糖转化率。

图3 普鲁兰酶对海藻糖转化率的影响Fig.3 Effects of pullulanase on the production of trehalose

2.4.2 加酶量、温度、pH和底物浓度对海藻糖制备的影响 本研究对酶法制备海藻糖的条件进行了优化，主要优化MTSase和MTHase的加量、酶转化的温度、pH以及底物质量浓度。结果如图4所示。

加酶量是影响酶反应产物产率的重要因素，并且还与成本有关。此外，由于MTSase和MTHase分别催化底物还原性末端的转糖苷反应和麦芽寡糖基海藻糖的水解反应，两者的使用比例对于产物组分组成具有重要影响。为了探究不同加酶量对海藻糖制备的影响，本研究在pH 5.5和55℃条件下考察了MTSase和MTHase不同的浓度和比例时的海藻糖转化率。结果表明，当MTSase和MTHase的比例为4∶1，加酶量分别为80.0 U/g淀粉和20.0 U/g淀粉时海藻糖转化率最高。

温度也会影响酶转化的结果，为了研究温度对MTSase和MTHase双酶法制备海藻糖的影响，本研究在4个不同温度下进行酶转化反应。当温度分别为 50、55、60、65 ℃时， 海藻糖转化率分别为：61.2%、74.4%、75.9%、65.1%。由数据可知，当在一定温度范围内，随温度的升高，海藻糖的转化率也会相应提高，但是在达到最适温度60℃后，海藻糖的转化率随温度的升高而呈现下降趋势。

不同的初始pH会对酶的活力及稳定性产生不同程度的影响，也会影响到酶转化的效果，因此探究了不同初始pH对转化率的影响。结果显示当pH为5.5时，海藻糖对麦芽糊精的转化率最高，能达76.0%。因此，酶转化反应最适pH为5.5。

另外，底物质量浓度对酶转化结果也有一定的影响，本研究考察了4种不同的底物质量浓度下海藻糖的转化率。当底物质量浓度分别为100、150、200、250、300 g/L时，海藻糖转化率分别为78.8%、78.6%、76.4%、74.2%、70.4%，随着底物质量浓度的升高，海藻糖转化率逐渐降低。

因此，海藻糖制备的最佳条件为：100 g/L马铃薯淀粉为底物，酶转化温度为60℃，pH为5.5，加酶量为MTSase 80 U/g淀粉、MTHase 20 U/g淀粉。

图4 不同反应条件对海藻糖转化率的影响Fig.4 Effects of different reaction conditions on the production of trehalose

2.4.3 CGTase对海藻糖制备的影响 从上述研究结果可以看出，反应产物中含有较多的葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖等小分子糖，研究表明，MTSase对DP值较高的麦芽寡糖或糊精等底物的亲和力较高，而不能有效利用本研究中反应副产物小分子糖，造成底物浪费。CGTase是一种多功能糖基转移酶，能催化糖分子之间的转糖基作用，使此类小分子糖转化生成糖链长度加长的产物[25]。由此推测CGTase能催化产物中无法利用的二糖以及三糖发生转糖基反应生成MTSase酶反应底物，从而提高海藻糖的转化率。因此，继续探究了添加CGTase对海藻糖转化率的影响，并考察了不同添加时间的酶转化情况。如图5所示，不加CGTase时，海藻糖转化率为76.2%；反应初始加入CGTase时，海藻糖转化率为80.2%；12 h和24 h时加入CGTase均下降，分别为78.7%和77.5%，说明添加CGTase能提高海藻糖产量，并且加入时间越早，转化率提高越明显。此外，与预期一致，反应产物中的麦芽糖及其他组分的含量均明显下降，但葡萄糖的含量有所增加，这可能与CGTase的水解活性有关。

3 结 语

图5 CGTase对海藻糖转化率的影响Fig.5 Effects of CGTase on the production of trehalose

本研究首次将（Sulfolobus acidocaldarius）ATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶在Brevibacillus brevis中进行了克隆表达，重组菌在TM培养基中发酵48 h，胞内酶活力分别达到 MTSase 630.0 U/g （wet cell）、MTHase 170.0 U/g（wet cell）。在此基础上探究了双酶法制备海藻糖的工艺。对重组MTSase和MTHase进行酶转化实验，结果表明，当以150 g/L马铃薯淀粉为底物，酶转化温度为 60℃，pH为 5.5，加酶量为MTSase 80 U/g淀粉、MTHase 20 U/g淀粉，普鲁兰酶5 U/g淀粉和环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）15 U/g淀粉，反应48 h，海藻糖转化率达到80.2%。