共表达N-乙酰转移酶和磷脂酶重组菌的构建及发酵优化

吉得宁 ， 宿玲恰 ， 吴 敬 ， 吴 丹 *

（1．食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；2．江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）

磷脂酶 （phospholipase，NCBI，EGU84973.1）是可以将磷脂水解为小分子脂肪酸、甘二酯和磷酸胆碱的一类酶的简称[1]。目前磷脂酶被应用在很多方面，例如制作面包、蛋黄[2]、植物油的精炼等方面，特别突出的是在油脂脱胶方面[3]。与传统的物理脱胶方法相比，酶法脱胶可以大大减少化学品的消耗和几乎不产生任何废水，形成了一种经济，高效，稳定的绿色油脱胶工艺。过去的几十年中，由于磷脂酶具有的巨大商业价值，吸引了大量的研究。国内外关于磷脂酶制备的研究主要集中于磷脂酶基因在异源宿主系统进行表达，来源于米曲霉[4]、酿酒酵母[5]、粗糙脉孢菌[6]的磷脂酶基因，已经成功克隆表达。据报道，磷脂酶基因异源表达的宿主包括大肠杆菌[7]、米曲霉、酿酒酵母[4]、黑曲霉[8]等，主要通过发酵优化提高磷脂酶的表达水平。

来源于尖孢镰刀菌的磷脂酶基因，目前并未有报道该基因在P.pastoris中克隆表达和优化，为了提高磷脂酶的表达量，本文选择高表达量的毕赤酵母表达系统[9-10]。甲醇利用型巴斯德毕赤酵母具有高表达、高稳定、高分泌、容易放大、成本低等优点，同时可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，已被广泛用于表达多种蛋白[11]。近年来研究在重组毕赤酵母中，表达另外一种酶可以提高目标蛋白的表达量。在酵母、霉菌、植物等生物体中发现一种N-乙酰转移酶（Mpr1）[12]。Mpr1是一类能催化乙酰基团在乙酰辅酶A和胺之间转移的酶。Mpr1具有显著的抗ROS氧化胁迫生理功能，增加温度耐受度[13]，以及冻干耐受度[14]等，从而显著提高细胞活性，提高磷脂酶在毕赤酵母中的表达量。

前期工作发现来源于尖孢镰刀菌的磷脂酶基因，具有很好的稳定性和应用性，构建磷脂酶在毕赤酵母中克隆表达的重组菌。在前期工作的基础上，为了进一步提高磷脂酶在毕赤酵母中的表达量，本研究构建了N-乙酰转移酶在P.pastoris KM71/pPIC9K-phospholipase中表达的重组毕赤酵母菌株，并探究其在3.6 L发酵罐中诱导表达磷脂酶的最佳条件，为工业化应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 重组P.pastoris KM71/pPIC9K-phospholipase菌株和重组质粒pPICZA-Mpr1由本实验室构建并保存。P.pastoris表达质粒pPICZA购于美国Invitrogen公司。

1.1.2 培养基 YPD培养基：10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖。

BMMY培养基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，YNB 13.4 g/L，生物素 4×10-4g/L，甲醇 40 g/L。

BMGY培养基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，YNB 13.4 g/L，甘油 10 g/L，生物素 4×10-4g/L。

种子培养基：10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，YNB 13.4 g/L，甘油 30 g/L。

BSM培养基：85%磷酸 26.7 ml/L，二水硫酸钙0.93 g/L，硫酸钾 18.2 g/L。

七水硫酸镁 14.9 g/L，氢氧化钾 4.13 g/L，甘油30 g/L，PTM1 4.35 ml/L。

PTM1低盐溶液：硫酸铜 6 g/L，碘化钾 0.08 g/L，一水硫酸锰 3.0 g/L。

钼酸钠 0.2 g/L，硼酸 0.2 g/L，氯化钴 0.5 g/L，氯化锌 20.0 g/L，七水硫酸亚铁65.0 g/L，生物素0.2 g/L，浓硫酸 5.0 ml/L。

补料生长培养基：质量浓度为500 g/L的甘油（含 12 ml/L PTM1）。

甲醇诱导培养基：100%甲醇 （含 12 ml/L PTM1）。

1.1.3 试剂 蛋白胨、酵母抽提物购自Oxiod，酵母无氨基基本氮源培养基（YNB）、遗传霉素G418购自上海生工生物工程公司。其他均为国产分析纯试剂。

1.1.4 主要仪器 超净工作台购自苏州科盛有限制造公司；恒温水浴摇床购自江苏金坛亿通电子有限公司；凝胶成像仪、蛋白电泳仪购自美国Bio-Rad公司；3.6 L Infors全自动发酵罐购自伊孚森生物技术有限公司（中国）；FC-2002型甲醇浓度检测流加仪购自上海苏波信息技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重组P.pastorisKM71/pPIC9K-phospholipase/pPICZA-MPR1的构建与筛选 载体的线性化通过使用限制性内切酶Sac I进行，酶切体系（60 μL）如表 1 所示。

表1 酶切体系Table 1 Digested system

上述各组分充分混匀，37℃水浴约2 h，然后进行核酸琼脂糖凝胶电泳验证，凝胶成像仪下看目的片段，正确后胶回收。

（1）将 6 μL左右的线性化 DNA 加入 80 μL酵母感受态细胞混合，转至提前预冷的2 mm电转杯，设置电压2 500 V，快速电击，将电击时间控制4～10 ms。

（2）结束后将1 mL 1 mol/L山梨醇（提前预冷）迅速与菌体充分混匀，然后将其转移至1.5 mL无菌EP中，30℃、50 r/min温浴约 2 h。

（3）将上述处理好的菌液均匀涂布在含质量浓度0.5 mg/mL遗传霉素（G418）抗性MD平板上，于30℃恒温条件下培养，直至长出单菌落。

（4）牙签挑取MD平板上的菌落，点种到YPD平板（Zeocin抗性）上，分别将Zeocin质量浓度梯度设为 0.5，1，2 mg/mL。

（5）挑取Zeocin抗性质量浓度为2 mg/mL平板上的转化子接种到YPD培养基 （10 mL）中，30℃，200 r/min培养24 h左右，进行表达验证。

1.2.2 摇瓶发酵产磷脂酶 摇瓶发酵：从-80℃保藏的甘油管中以2%的接种量接种至YPD液体培养基，培养24 h。然后取2.5 mL转接BMGY培养基，培养24 h，转移至BMMY，加入甲醇于30℃进行诱导，诱导后120 h取样测酶活，诱导120 h时，离心取得上清即为粗酶。

1.2.3 种子摇瓶培养 从甘油管中接200 μL菌液于100 mL发酵种子培养基中（100 mL培养基/500 mL三角瓶），于30℃、200 r/min培养24 h。

1.2.4 补料高密度共表达发酵 甘油分批发酵阶段：将发酵种子培养基中菌液按10%接种量接入装有900 mL BSM培养基的3.6 L全自动发酵罐中分批培养（以25%氨水控制pH 5.0，温度30℃），调节搅拌转速和通气量维持溶氧在30%以上。

甘油补料分批培养阶段：当甘油耗尽（约18 h）时溶氧（DO）迅速上升，此时通过溶氧反馈调节以16.3 mL/（L·h）的流速控制流加补料生长培养基。

甲醇诱导发酵阶段：当菌体达到一定质量浓度后停止补料，并让菌体饥饿约30～60 min，然后通过FC2002型甲醇监测流加控制器 （华东理工大学，上海）控制流加可维持恒定质量浓度的甲醇诱导培养基，诱导凝乳酶的表达。发酵控制过程由发酵罐控制系统软件进行在线控制和数据采集。

1.2.5 菌体生物量的测定 采用比色法，将菌液稀释到一定倍数后用Bio-photometer于波长600 nm处以去离子水为对照进行比色测定，以波长600 nm吸光度的数值在0.2～0.8之间为原则，OD600=OD读数×稀释倍数，确定OD600的数值。称量干燥的5 mL离心管，取4 mL菌液放于其中，离心去上清，然后在105℃下烘干至恒重，称量并计算菌体质量浓度。

1.2.6 蛋白含量的测定 重组P.pastoris发酵液中总蛋白含量的测定采用Bradford法，以牛血清蛋白为表样制作标准曲线。

1.2.7 磷脂酶酶活测定方法 将200 μL适当稀释的酶液加入到10 mL含有大豆卵磷脂的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（50 mmol/L，pH 5.0）中，使大豆卵磷脂的终质量浓度为40 g/L。振荡混匀后置55℃水浴锅中反应5 min，加入终止剂95%的乙醇，振荡，加入100 μL的酚酞，然后于自动滴定仪下用NaOH标准溶液滴定，观察颜色，确定空白颜色变色临界点为滴定的终点，将样品与空白滴定后的颜色一致，计算标准碱液平均消耗量。磷脂酶酶活力定义为：在特定条件下 1 min水解磷脂产生1 μmol量游离脂肪酸所需的酶量即为一个磷脂酶活力单位（U）。

计算公式为其中，X为样品的酶活力，U/mL；V为滴定样品时消耗的NaOH标准溶液体积，mL；V0为滴定空白时消耗的 NaOH标准溶液体积，mL；c为NaOH标准溶液的浓度，mol/L，50～0.05 mol/L NaOH 标准溶液1.0 mL相当于脂肪酸50 μmol；n为酶液样品的稀释倍数；t为测定酶活时的反应时间。

2 结果和讨论

2.1 重组菌P.pastorisKM71/pPIC9K-phospholipase/pPICZA-Mpr1的构建和摇瓶发酵

2.1.1 重组菌株 P.pastorisKM71/pPIC9K-phospholipase/pPICZA-Mpr1的构建和筛选 将前期工作构建好的重组质粒pPICZA-Mpr1（图1），用Sac I线性化[15]，然后电转至 P.pastoris KM71/pPIC9K-phospholipase感受态细胞，由于在P.pastoris染色体中已经有pPIC9K-phospholipase（图2），其携带有G418抗性基因，可直接涂布G418抗性质量浓度为0.5 mg/mL MD平板[16]。挑取抗性MD板上长出的重组转化子，点接到Zeocin抗性质量浓度分别为0.5、1、2 mg/mL的抗性YPD平板中。表达载体pPICZA有Zeocin抗性，可以通过筛选重组菌抗Zeocin的能力来获得高拷贝数目的基因转化子，最后在2 mg/mL Zeocin抗性质量浓度的YPD平板上挑选出转化子。

2.1.2 重组菌株 P.pastorisKM71/pPIC9K-phospholipase/pPICZA-Mpr1的摇瓶产酶 将筛选出来的重组毕赤酵母菌株摇瓶发酵，诱导120 h后表达磷脂酶胞外酶活达到最大值为850 U/mL，是前期磷脂酶单独表达胞外上清酶活的1.3倍。重组菌株表达的磷脂酶的SDS-PAGE电泳（图3）显示，在30 kDa处有目的蛋白条带，与理论的磷脂酶分子量相符合。综上所述：Mpr1在P.pastoris KM71/pPIC9K-phospholipase中的表达可以提高磷脂酶的表达量。

图1pPICZA-Mpr1重组质粒图谱Fig.1 pPICZA-Mpr1 recombinant plasmid map

图2 pPIC9K-phospholipase重组质粒图谱Fig.2 pPIC9K-phospholipase recombinant plasmid map

2.2 3.6 L发酵罐中高密度发酵生产磷脂酶

图3 Mpr1和磷脂酶重组菌胞外上清液聚丙烯酰胺凝胶电泳Fig.3 SDS-PAGE analysis of the extracellular supernatant in the recombinant strain

2.2.1 不同的诱导温度对菌体生长及产磷脂酶的影响 P.pastoris高密度发酵是工业化生产外源重组蛋白的一个重要途径。温度是影响菌体生长和目的蛋白表达的很重要的因素[17-18]。升高温度，有利于菌体的生长，过高的温度将会影响菌体正常的生长和目的蛋白的表达。本次实验研究了在3.6 L发酵罐中菌体质量浓度为40 g/L开始诱导，诱导甲醇体积分数为1.0%，诱导温度分别为28，30，32℃三个条件，进行诱导温度的优化。

如图4所示，当诱导温度为28、30℃时，菌体的生长是随着时间的增加而逐渐递增的，在诱导110 h后菌体浓度趋于稳定，分别为201、199 g/L。当诱导温度为32℃时，诱导0～90 h菌体的生物量随着诱导时间的增加而增加，但是当诱导时间在90～120 h时，发酵后期菌体的浓度开始逐渐降低，最后诱导120 h的菌体生物量为182 g/L。当诱导温度超过30℃，可能由于温度过高，影响菌体的生长，菌体开始裂解，所以应将诱导温度控制在30℃以下。

如图5所示，磷脂酶的表达量随着诱导温度的降低，表达量越高。诱导温度从28℃增加到30℃时，诱导120 h后，磷脂酶的酶活由8 100 U/mL降为6 050 U/mL。当诱导温度从30℃增加到32℃时，磷脂酶的酶活由6 050 U/mL降为5 100 U/mL。当诱导温度为28℃时，诱导120 h的蛋白表达量分别为8.3 mg/mL，分别是诱导温度为 30、32℃的1.32、1.56倍。由此得知，诱导温度越低，酶的蛋白表达量越高。较低的温度诱导，可以稳定细胞膜和更加有效地降低蛋白酶的水解率，从而提高酶的表达量[19]。工业生产上诱导温度低于28℃，具有生产成本高、制冷设备的承受能力要求高和工艺的可放大性可能性小的缺点，所以重组菌最优的发酵条件为28℃。

图4 不同诱导温度菌体生长的影响Fig.4 Effect of different temperatures on cell growth during the induction phase

图5 不同诱导温度对磷脂酶表达的影响Fig.5 Effect of different temperatures on the phospholipase expression during the induction phase

2.2.2 不同的初始诱导生物量对菌体生长及产磷脂酶的影响 不同的初始诱导菌体质量浓度对于产酶的影响是很关键的[20]。通常情况下外源蛋白的最终表达量与初始诱导菌体质量浓度成正比，菌体质量浓度越高，蛋白的表达量就越高[21]，但是当生物量达到过高水平时，培养条件容易受到制约，外源蛋白的产量和稳定性也会受到影响。为考察初始菌体质量浓度对菌体生长和产磷脂酶的影响，本研究在3.6 L罐中初始发酵培养基中的甘油耗尽，开始指数流加不同体积的甘油，至菌体质量浓度分别达到20、40、60 g/L三个不同菌质量浓度时开始诱导；诱导阶段通过甲醇电极维持1.0%的甲醇体积分数，诱导温度28℃，诱导120 h后，观察菌体生长和发酵产酶的情况。

由图6可知，在诱导前100 h，初始诱导菌体质量浓度对菌体生长的影响较明显，但是达到稳定期后菌体质量浓度基本保持稳定。在初始诱导菌体生物量为60 g/L时，诱导120 h后生物量达到最高，同时结合图7可知，当初始诱导菌质量浓度由20 g/L增加到40 g/L时，诱导120 h后磷脂酶酶活由6 230 U/mL增加到8 100 U/mL，当初始诱导菌质量浓度从40 g/L增加到60 g/L时，磷脂酶酶活则由8 100 U/mL下降到7 250 U/mL，因此初始诱导菌质量浓度为40 g/L时磷脂酶的表达量最高，最终细胞质量浓度维持在201 g/L左右，此时磷脂酶的生长情况和产酶情况最优。本次研究Mpr1和磷脂酶在P.pastoris中共表达中发现，磷脂酶的表达量并不是一直和初始诱导菌质量浓度成正比，而是在合适的生物量时诱导能较明显地提高重组酶表达量，这样既能维持细胞平稳生长，又能提高磷脂酶的表达量。因此本实验最优的初始诱导生物量为40 g/L。

图6 不同起始诱导菌体质量浓度对菌体生长的影响Fig.6 Effect of different initial induction cell density on cellgrowth and the phospholipaseexpression during the induction phase

图7 不同起始诱导菌体质量浓度对磷脂酶表达的影响Fig.7 Effect of different initial induction cell density on the phospholipase expression during the induction phase

2.2.3 不同的甲醇诱导体积分数对菌体生长及产磷脂酶的影响 P.pastoris表达外源蛋白的过程中，诱导阶段甲醇体积分数不仅会影响细胞生长，与外源蛋白的表达产量也存在很大关系。甲醇作为诱导阶段唯一碳源和诱导剂，通过诱导细胞产生甲醇代谢所需醇氧化酶后消耗甲醇为细胞生长产酶提供能量，同时诱导外源蛋白表达，但在代谢甲醇过程中产生的甲醛和，等小分子过氧化物会对细胞产生毒害作用，因此如何控制合适的甲醇体积分数是高密度诱导发酵关键因素之一。本次研究中，初始诱导菌体质量浓度控制在40 g/L、诱导温度为28℃，探究了不同甲醇体积分数对菌体生长及产磷脂酶的影响。

菌体的生长情况如图8所示，甲醇体积分数维持分别在0.5%、1.0%、1.5%，诱导120 h后菌体质量浓度分别为199、200、195 g/L。菌体质量浓度大体一致，但是从整个诱导过程中可以看出甲醇体积分数为0.5%、1.0%比1.5%生长得好，说明在1.5%体积分数甲醇条件下，细胞生长受到抑制，维持较高体积分数甲醇不利于细胞生长。

图9显示不同甲醇体积分数下细胞产酶水平变化，甲醇诱导体积分数为1.0%时，磷脂酶的酶活单位是甲醇诱导体积分数分别为0.5%、1.5%的1.14、1.3倍。诱导甲醇体积分数为0.5%的蛋白表达量高于甲醇体积分数为1.5%，所以过高的甲醇体积分数不利于酶的表达。在适合的甲醇体积分数条件下，磷脂酶的酶活和蛋白表达量达到最高。但是较高的甲醇体积分数可能会产生毒素，影响细胞中的代谢途径，导致酶的表达量降低[22]。所以重组菌发酵产生磷脂酶最优的甲醇诱导体积分数为1.0%。

图8 不同体积分数甲醇诱导对菌体生长的影响Fig.8 Effect of different methanol concentration on cell growth during the induction phase

图9 不同体积分数甲醇诱导对磷脂酶表达的影响Fig.9 Effect of different methanol concentration on the phospholipaseexpression during theinduction phase

3 结 语

本研究中构建重组菌株P.pastoris KM71/pPIC9K-phospholipase/pPICZA-Mpr1和重组菌在3.6 L发酵罐中发酵工艺进行优化。摇瓶发酵初步研究得到胞外上清酶活850 U/mL，是前期磷脂酶单独表达的1.3倍。重组P.pastoris KM71/pPIC9K-phospholipase/pPICZA-Mpr1菌株进行最佳发酵条件的探究，通过考察不同的诱导温度、起始诱导生物量和甲醇诱导体积分数，确定其最佳发酵条件。结果表明，在温度为28℃，初始诱导菌体质量浓度为40 g/L，1.0%甲醇诱导体积分数时高密度发酵得到发酵上清的最大酶活可达到8 100 U/mL。这为后续磷脂酶进一步工业化生产奠定了基础。