半乳糖凝集素1，3在妊娠期高血压产妇胎盘中的表达及意义

胡丽芳，黄文珍,刘 彤

(武汉市第五医院 产科， 湖北 武汉 430050)

妊娠期高血压疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy，HDCP)是妊娠期妇女常见并发症，是引起围产期母婴死亡的主要原因之一[1]。对于HDCP的救治已成为广大妇产科医师亟待解决的棘手问题，探讨其发病机制具有重要意义。半乳糖凝集素家族属于糖结合蛋白的一种，通过与细胞表面的糖基化蛋白或者细胞外基质糖蛋白特异性结合发挥功能，具有广泛的生物活性，可诱导单核细胞趋化，抑制中性粒细胞渗出，降低宿主对同种异体物的免疫反应，促进免疫耐受[2-3]。半乳糖凝集素-1(galectin-1，Gal-1)和半乳糖凝集素-3(galectin-3，Gal-3)被证明参与了妊娠期糖尿病、子痫前期、复发性流产等多种妊娠期疾病的发病[4-5]。本研究以我院收治的70例HDCP产妇为研究对象，探讨产妇胎盘中Gal-1和Gal-3的表达及意义，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年3月到2017年6月我院收治的70例HDCP产妇作为观察组，均符合康宁主编《妇产科学》第8版有关妊娠期高血压的诊断标准[6]。70例HDCP产妇，年龄19～41岁，平均(26.4±5.7)岁；孕期27～40周，平均(36.5±2.9)周；妊娠期高血压57例，子痫前期13例。排除原发性高血压、糖尿病、高血脂、肝肾疾病以及多胎产妇。选取30例同期在我院体检的正常产妇作为对照组，年龄20～41岁，平均(25.4±6.3)岁，孕期25～40周，平均(35.3±3.2)周。各组产妇的年龄、体重指数、孕周、初潮年龄、流产史、生育史等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。所有产妇均知情同意并签署知情同意书，经本院医学伦理委员会批准。

表1各组产妇的一般资料比较

组别例数年龄(岁)体重指数(kg/m2)孕周(周)初潮年龄(岁)流产史(次)生育史(次)观察7026.4±5.7*25.9±4.3*36.5±2.9*11.3±1.5*1.4±0.3*1.4±0.4* 妊娠期高血压5725.8±5.9*25.4±4.6*36.1±3.1*11.5±1.4*1.3±0.5*1.4±0.3* 子痫前期1326.7±6.1*#26.5±4.0*#36.9±2.5*#10.8±1.6*#1.5±0.3*#1.5±0.2*#对照3025.4±6.326.4±4.135.3±3.210.8±1.31.4±0.51.5±0.3

与对照组比较，*：P>0.05；与妊娠期高血压比较，#：P>0.05。

1.2 治疗方法 HDCP治疗基本原则是休息、镇静、解痉，有指征的降压、利尿，密切监测母胎情况，适时终止妊娠。对于收缩压≥140 mmHg 和(或) 舒张压 ≥ 90 mmHg的患者酌情使用降压药，主要有拉贝洛尔、硝苯地平缓释片；部分口服降压不理想的患者可静脉滴注拉贝洛尔、酚妥拉明。对于痉挛患者可使用硫酸镁解痉。对于并发心衰、肺水肿、脑水肿、全身浮肿、肾功能不全的少尿无尿患者，酌情使用呋塞米、甘露醇利尿。

1.3 标本采集 胎盘娩出后，取1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm胎盘组织，注意避开钙化和坏死区域，用无菌生理盐水冲洗干净。一份胎盘组织经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，保存待检；另一份胎盘组织剪碎后加入组织裂解液，匀浆、离心后取上清，-20 ℃保存待检。

1.4 免疫组织化学法检测Gal-1和Gal-3表达 取出保存的胎盘组织石蜡切片，60 ℃烘箱烤片60 min，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，柠檬酸高压抗原修复，磷酸盐洗液(PBS)淋洗，3%过氧化氢溶液室温孵育10 min，PBS淋洗，滴加兔抗人一抗(抗Gal-1，抗Gal-3，抗体滴度均为0.1 μg/mL，可按1∶1 000稀释)，4℃孵育过夜，PBS淋洗，滴加羊抗兔二抗(抗体滴度为0.5 μg/mL，可按1∶5 000稀释)，室温孵育30 min，PBS淋洗，DAB显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照以PBS作为一抗代替。参照文献[7]，光学显微镜下观察染色情况，以阳性细胞比例和染色强度两方面进行综合评分。阳性细胞比例低于5%，计0分；阳性细胞比例占5%～30%，计1分；阳性细胞比例占31%～60%，计2分；阳性细胞比例大于60%，计3分。棕色染色计3分，浅棕色染色计2分，浅黄色染色计1分，无染色计0分。两项评分相乘即为最终评分，0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性(++)，6～9分为强阳性(+++)。

1.5 蛋白印迹法检测Gal-1和Gal-3表达 取出保存的胎盘组织匀浆上清液，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，取100 μg蛋白上样，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳分离，转至聚偏氟乙烯膜(PVDF)。TBST漂洗，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入兔抗人一抗(抗Gal-1，抗Gal-3)工作液(1∶500)，4 ℃孵育过夜。TBST漂洗，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗工作液(1∶500)，37 ℃孵育1 h。TBST漂洗，暗室内二氨基联苯胺(DAB)显色、曝光。BioRad系统分析，目的蛋白表达量=目的蛋白光密度值/GAPDH光密度值。

2 结果

2.1 产妇胎盘组织细胞中Gal-1和Gal-3阳性比例比较 Kruskal-WallisH秩和检验结果显示：观察组产妇胎盘组织Gal-1和Gal-3表达明显高于对照组(P<0.05)；子痫前期产妇胎盘组织中Gal-1和Gal-3表达明显高于妊娠期高血压产妇和对照组(P<0.05)，而妊娠期高血压产妇胎盘组织中Gal-1和Gal-3表达明显高于对照组(P<0.05)。

表2产妇胎盘组织Gal-1和Gal-3表达比较

组别例数Gal-1-++++++Gal-3-++++++观察701181734972133 妊娠期高血压571171524861924 子痫前期13012101129对照30127101106113

A：对照组胎盘组织Gal-1表达；B：妊娠期高血压产妇胎盘组织Gal-1表达；C：子痫前期产妇胎盘组织Gal-1表达；D：对照组胎盘组织Gal-3表达；E：妊娠期高血压产妇胎盘组织Gal-3表达；F：子痫前期产妇胎盘组织Gal-3表达。图1 免疫组织化学法检测各组产妇胎盘组织Gal-1和Gal-3表达(×400)

2.2 产妇胎盘组织Gal-1和Gal-3蛋白表达量比较 子痫前期产妇、妊娠期高血压产妇和对照组产妇胎盘组织Gal-1和Gal-3蛋白水平比较存在显著性差异(P<0.05)，其中子痫前期产妇胎盘组织Gal-1和Gal-3蛋白水平明显高于妊娠期高血压产妇和对照组产妇(P<0.05)，而妊娠期高血压产妇又明显高于对照组产妇(P<0.05)。

表3产妇胎盘组织Gal-1和Gal-3蛋白表达比较

组别例数Gal-1Gal-3观察700.52±0.13*0.57±0.13* 妊娠期高血压570.37±0.09*0.44±0.11* 子痫前期131.21±0.17*#1.13±0.14*#对照300.11±0.050.18±0.06

与对照组比较，*:P<0.05；与妊娠期高血压比较，#:P<0.05。

A：对照组；B：妊娠期高血压；C：子痫前期。 图2 蛋白印迹法检测各组产妇胎盘组织Gal-1和Gal-3表达

3 讨论

目前有关HDCP的发病机制尚不十分明确，一般认为与免疫调节功能异常和母胎免疫耐受失衡等众多因素有关[8-10]。生殖免疫学认为，正常妊娠是自然同种异体移植过程，母体需要容受部分由父亲基因编码的胚泡的植入，妊娠的成功有赖于胎儿与母体间免疫平衡的建立，当母胎免疫耐受失衡时就有可能引起免疫排斥导致病理妊娠[11-12]。胎盘局部免疫排斥反应异常，导致血管内皮细胞和功能损伤，被认为是引起HDCP的主要原因之一[13]。

半乳糖凝集素是一类能够选择性识别糖结构并与之以非共价结合的蛋白质，其家族分布广泛，存在于多种组织和细胞内[14]。Gal-1是第一个被发现的半乳糖凝集素家族成员之一，具有强大的免疫调节功能，能够抑制中性粒细胞渗出，下调促炎因子表达，抑制T 细胞活化，从而降低宿主对同种异体物的免疫反应，增强免疫耐受[15-16]。Terness等[17]学者的研究表明，Gal-1通过抑制T细胞活化并诱导其凋亡的方式来调节Th1/Th2细胞的平衡，从而调节免疫系统的平衡。Molvarec等[18]学者研究发现Gal-1在子痫前期产妇外周血中的表达显著增加。Gal-3在特定的条件下能够与T细胞受体结合，抑制T 细胞活化；能够抑制B 细胞向浆细胞分化，减少特异性抗体产生。Rappl等[19]学者研究表明Gal-3在调节胚胎种植部位的炎症反应方面发挥重要作用。Blois等[20]学者研究发现Gal-1和Gal-3基因敲除大鼠的流产率明显增加，当给予外源性Gal-1和Gal-3处理后，大鼠流产率明显降低。以上结果说明Gal-1和Gal-3在增强母胎免疫耐受，维持正常妊娠方面发挥重要作用。

本研究的结果显示，观察组产妇胎盘组织Gal-1和Gal-3表达均显著高于对照组，而且子痫前期产妇胎盘组织Gal-1和Gal-3表达明显高于妊娠期高血压产妇。说明Gal-1和Gal-3在HDCP产妇胎盘组织中的表达增加，而且与病情的严重程度有关。

综上所述，本研究发现HDCP产妇胎盘组织Gal-1和Gal-3表达显著增加，提示二者可能与HDCP的发生有关。由于条件所限，本研究仅检测了产妇胎盘组织Gal-1和Gal-3表达，有关其参与HDCP发生、发展的具体机制尚未阐明，欲深入探讨Gal-1和Gal-3与HDCP的关系，尚需更多、更全面的研究证实。