胃癌组织中LncRNA NNT-AS1的表达及意义

顾有花，熊峰，闫学平，周健，王月菊

(1 苏州大学附属第一医院，江苏苏州215006;2北京市第一中西医结合医院)

胃癌起源于胃黏膜上皮，是常见的消化道恶性肿瘤，世界范围内，其发病率位居第四，病死率仅低于肺癌，是癌症死因的第二位[1]。目前外科根治性切除术，结合或不结合其他抗肿瘤手段的综合治疗仍是胃癌的最佳治疗手段[2]。但多数胃癌患者确诊时已至中晚期，基础身体条件较差，较难开展手术。胃癌起病初期无明显症状，仅有患者主诉出现嗳气、上腹饱胀或隐痛等非特异性症状，与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病鉴别诊断困难[3]。长链非编码RNA(LncRNA)是表观遗传学的研究热点之一，近期多项研究表明LncRNA与阿尔兹海默症[4]、强直性肌营养不良[5]及多种恶性肿瘤[6]等复杂疾病密切相关。2012年6月～2016年12月，我们观察了胃癌组织中LncRNA烟酰胺核苷酸反义转氢酶RNA1(NNT-AS1)的表达，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取本院2012年6月～2016年12月收治的胃癌患者的胃癌组织及癌旁非肿瘤组织冻存标本77例份，标本由根治性胃癌切除术中切取，胃癌组织标本取自肿瘤组织中央非坏死区域，癌旁非肿瘤组织标本取自距离肿瘤组织5 cm以上非肿瘤组织。病例均经病理科确诊为原发性胃癌。其中男51例、女26例，年龄为50～80岁，≤60岁23例、>60岁54例。TNM分期Ⅰ期9例，Ⅱ期30例，Ⅲ期35例，Ⅳ期3例；经病理科确诊胃腺癌75例，胃印戒细胞癌2例；组织分化程度为高分化9例，中分化39例，低分化29例；脉管侵袭36例；淋巴结转移37例；神经转移16例。纳入标准：①经病理科确诊为原发性胃癌；②患者病历资料、随访资料完整；③患者胃癌组织、癌旁组织冻存标本保存完好；④术前未经放、化疗等其他抗肿瘤手段治疗；⑤未合并其他恶性肿瘤；⑥未合并其他影响RT-PCR结果的严重疾病。本研究经医学伦理委员会批准，患者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 LncRNA NNT-AS1表达检测 采用RT-PCR法。向称取的等量冻存样本中加入TRIzol试剂(美国Invitrogen 公司)提取总RNA。以紫外分光光度计检测总RNA纯度，符合本研究要求的总RNA样本OD260/OD280位于1.8～2.0。应用High-capacity cDNA Reverse Transcription kit(美国Thermo Fisher公司)将总RNA逆转录为cDNA。本研究RT-PCR过程严格遵循Roche Light Cycler®480 Ⅱ荧光定量PCR仪(本实验室自有)产品说明书，使用TaqMan®Universal Master Mix Ⅱ without UNG预混液(美国Invitrogen公司)，以β-actin为内参，反应引物序列：LncRNA NNT-AS1正向引物：5′-TGAAGTTTTCAGGGACACAT-3′，反向引物：5′-TTTAGACCTGTTTCTTTGTT-3′；β-actin正向引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，反向引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。以2-ΔΔCt法计算LncRNA NNT-AS1的相对表达量。

1.3 随访 以患者术后出院为观察起点，应用电话、电子通讯等手段，对患者及家属进行随访。随访截止于2017年12月，随访10～65(36.48±15.15)个月，中位随访时长为36个月。

2 结果

2.1 不同胃部组织中LncRNA NNT-AS1表达比较 胃癌及癌旁正常组织中LncRNA NNT-AS1相对表达量分别为0.509±0.110、0.103±0.004，二者比较差异有统计学意义(t=32.366，P=0.000)。

2.2 胃癌组织中LncRNA NNT-AS1表达与患者临床病理特征的关系 LncRNA NNT-AS1在胃癌组织中的表达与患者肿瘤分化程度、TNM分期、脉管侵袭、淋巴结转移相关(P均<0.05)，而与患者年龄、性别、神经侵袭无关(P均>0.05)。见表1。

表1 胃癌组织中LncRNA NNT-AS1表达与患者临床病理特征的关系±s)

2.3 胃癌组织中LncRNA NNT-AS1表达与患者预后的关系 将纳入本研究的患者依照胃癌组织中LncRNA NNT-AS1在胃癌组织中的表达的算术平均值0.509分为LncRNA NNT-AS1低表达38例，高表达39例，将随访结果制成图1，LncRNA NNT-AS1低表达者生存率为68.42%(26/38)，生存时间为(52.03±3.11)个月，LncRNA NNT-AS1高表达者生存率为38.46%(15/39)，生存时间为(39.11±3.02)个月。胃癌组织中LncRNA NNT-AS1低表达者生存率与生存时间均优于LncRNA NNT-AS1高表达者(χ2=6.939，P=0.008；t=18.495，P=0.000)。

图1 LncRNA NNT-AS1低表达与高表达者Kaplan-Meier生存曲线

3 讨论

我国胃癌发病率全球范围内位居第二，仅次于日本，每年新增胃癌患者40万例，占全世界的42%左右，居我国恶性肿瘤发病率第二位，病死人数约30万例，病死率居我国因癌病死率第三位[1]。近年来，由于环境变化、幽门螺杆菌的感染、居民生活方式改变等原因，胃癌呈现年轻化趋势[7]，严重威胁我国国民身体健康。胃癌可依据病理类型分为胃腺癌、胃黏液腺癌及胃印戒细胞癌，不同病理类型的胃癌患者的临床病理特征有一定差异，但一般认为三种胃癌患者的预后差异无统计学意义，而目前的统计学数据显示，晚期胃癌患者术后5年生存率均不超过30%[7]。早期诊断、明确诊断并据此制定合理的治疗方案对患者预后至关重要，但我国以胃镜为主要早期筛查手段漏诊情况严重[8]。因此明确胃癌的发病机制，找到筛查依据及治疗靶点对于改善胃癌患者预后尤为重要。

LncRNA是一类不编码蛋白质的长度超过200 nt的功能性RNA，广泛分布于细胞核与细胞质中，在转录、转录后调控及表观遗传学层面上调控基因表达[9]。随着研究的深入，越来越多的证据表明LncRNA参与机体的诸多生物过程，更为重要的是，LncRNA具有成为肿瘤标记物的潜力[10]。已有许多LncRNA被证实与胃癌相关：LncRNA MEG3能通过p53信号通路抑制胃癌细胞的增殖与转移[11]；LncRNA SNHG6通过沉默p27信号通路促进胃癌细胞的上皮-间质转化作用，使患者预后恶化[12]；LncRNA SNHG1通过调控DNMT1表达，从而促进胃癌细胞增殖[13]。lncRNA BANCR在胃癌细胞中高表达，沉默lncRNA BANCR表达可抑制胃癌细胞的增殖、迁移能力。

本研究选择的LncRNA NNT-AS1定位于人类5号染色体，是一种新发现的LncRNA。Wang等[15]结合体内与体外实验发现，LncRNA NNT-AS1在结直肠癌组织中高表达，且能通过调控MAPK/ERK信号通路和肿瘤细胞的上皮-间质转化，促进结直肠癌细胞的增殖、转移与侵袭；Lu等[16]同样通过对临床肿瘤标本及体外细胞系的研究发现，LncRNA NNT-AS1在肝细胞癌组织中高表达，通过miR-363/CDK6信号簇参与促进肝细胞癌的进展与转移；Ye等[17]研究发现，LncRNA NNT-AS1在骨肉瘤组织中异常高表达，且表达较高的患者组生存率与生存时间均较对照组差。本研究发现，LncRNA NNT-AS1在胃癌组织中异常高表达，与前述其他恶性肿瘤中的表现一致，提示LncRNA NNT-AS1可作为恶性肿瘤的早期筛查指标，且胃癌组织中LncRNA NNT-AS1表达与肿瘤分化程度、TNM分期、脉管侵袭、淋巴结转移密切相关，提示LncRNA NNT-AS1能促进胃癌细胞增殖与转移，与前述研究中LncRNA NNT-AS1在其他恶性肿瘤中的作用相似，因此LncRNA NNT-AS1在多种恶性肿瘤中表现为促癌基因，可能成为新型抗癌手段的治疗靶点。但本研究结果中LncRNA NNT-AS1表达与胃癌的神经侵袭无关，可能因为LncRNA NNT-AS1对胃癌转移的促进途径与神经细胞、神经系统的基因表达无关，亦可能因本研究选择的患者中仅16例发现胃癌的神经侵袭，存在统计偏差。因此LncRNA NNT-AS1在胃癌中的作用机制尚需进一步实验证实。

本研究随访调查结果显示，LncRNA NNT-AS1表达较高的患者生存率、生存时间均劣于LncRNA NNT-AS1表达较低的患者，此可能与LncRNA NNT-AS1对于胃癌转移的促进作用相关，因此LncRNA NNT-AS1可作为胃癌患者预后评估的指标。对于LncRNA NNT-AS1表达较高的患者，建议重视复诊，加强监控，适当增加其他辅助抗肿瘤手段，以改善患者预后。

综上所述，胃癌组织中LncRNA NNT-AS1呈异常高表达，且与胃癌的恶性进展密切相关。LncRNA NNT-AS1表达较高的患者预后较差。因此LncRNA NNT-AS1具有成为胃癌早期诊断、预后评估相关肿瘤标记物的潜力。