附子理中丸对脾阳虚大鼠小肠上皮细胞CREB、Sirt1、UCP2表达和ATP合成的影响

孙大宇，单德红，刘旭东，刘文俊，王德山

(辽宁中医药大学生理教研室，沈阳110847)

脾的运化功能一定程度上取决于小肠上皮细胞对营养物质的吸收转运能力，其动力与小肠上皮细胞线粒体氧化呼吸链的功能密切相关。1976年，Nicholls首次发现能介导质子漏的蛋白并命名为解偶联蛋白(UCP)[1]。UCPs家族单蛋白表达部位不尽相同，其中UCP2表达广泛，如在白色脂肪组织、脾、肾、胰岛、肺及脑部多种组织中均有表达，胃肠道亦有表达[2]。目前认为，UCP2的主要功能是调控ATP合成，清除线粒体内的氧化磷酸化过程中产生的氧自由基ROS，质子通道作用等[3～5]。UCP2作为底物可直接被环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)-信息沉默调节因子1(Sirt1)信号通路活化而发挥生物学效应[6～10]。本实验通过观察附子理中丸对脾阳虚大鼠小肠上皮细胞CREB、Sirt1、UCP2表达和ATP合成的影响，旨在为“脾主运化”理论的外周性调控机制研究提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 实验动物、试剂及仪器 SPF级SD雄性大鼠40只，7～8周龄，体质量(220±10)g。Rabbit-anti-rat UCP2一抗10 μL(美国Santa Cruz公司,稀释倍数1∶200)，Rabbit-anti-rat CREB一抗10 μL(美国Santa Cruz公司,稀释倍数1∶200)，Mouse-anti-rat SIRT1一抗5 μL(美国Abcam公司，稀释倍数：1∶1 000)。组织线粒体分离试剂盒、100 mmol/mL苯甲基磺酰氟(PMSF)溶液(上海碧云天生物技术有限公司南通分公司)，PBS缓冲液(0.1 mol/L,pH 7.4)，柠檬酸缓冲液(0.01 mol/L、pH6.0)，蛋白酶抑制剂(美国 Sigma 公司),TRIzol裂解液(美国 Invitrogen公司)。Bio-Rad iMark酶标仪(美国伯乐，波长范围400～750 nm)，PCR扩增仪(TP650 德国Biometra公司)，SDS-PAGE仪(APC300，美国BIO-RAD公司)，垂直电泳槽(Mini RPOTEANII cell，美国BIO-ARD公司),数字型可调移液器(100～1 000 μL，美国热电公司)，图像分析系统 (美国 UVP)等。

1.2 动物分组及模型复制 大鼠适应性饲养1周后，按体质量分层后，按随机数字表法分为4组：空白对照组(空白组)、脾阳虚模型组(模型组)、附子理中丸治疗组(中药组)、脾阳虚自然恢复组(自愈组)，每组10只。空白组不施加任何干预因素。模型组：采用饮食失节+劳倦等复合因素方法，即饱食1 d，禁食2 d，每日游泳至力竭，连续2周，复制脾气虚模型，在此基础上应用“苦寒泻下”法，通过灌服100%番泻叶，1 mL/100 g，2次/d，连续2周，复制脾阳虚模型。中药组和自愈组按模型组方法复制动物模型。模型建立后，中药组给予附子理中丸1∶1水溶液灌胃，给药量2 mL/(100 g·d)，连续2周。模型评价标准采用主症+次症法[11,12]。

1.3 小肠上皮黏膜细胞中CREB、 Sirt1及线粒体UCP2蛋白表达检测 采用Western blotting法。各组大鼠于实验第43天禁食24 h后取材，经腹腔注射10%水合氯醛0.5 mL/100 g麻醉，常规开腹，剪取十二指肠下3 cm处肠管组织，迅速于4 ℃生理盐水中清洗，至于冰袋上无菌滤纸上吸干多余水分，眼科剪纵向剪开肠管，用医用无菌棉签轻拭肠腔表面，用无菌载玻片轻轻刮取黏膜层组织约100 mg，置于冷存管中液氮冷冻，于-80 ℃超低温冰箱保存。应用组织线粒体分离试剂盒提取线粒体蛋白。用眼科剪轻轻剪碎EP管中标本，加入10倍体积预冷的线粒体分离试剂A，在添加线粒体分离试剂A前数分钟内先加入适量的PMSF溶液，使其终浓度达到1 mmol/mL。在冰浴上高速匀浆机研磨2 min，低温低速离心机600 r/min，4 ℃离心5 min。将上清液移至另一个无菌EP管中，低温高速离心机11 000 r/min，4 ℃离心10 min，管中沉淀即为所获得的线粒体。再次将上清液移至新的EP管中，12 000 r/min，4 ℃离心10 min，提取上清至新的EP管中，即获得细胞胞质蛋白。对获得的线粒体加入150～200 mL线粒体裂解液进行裂解。按照试剂盒说明书操作，酶标仪波长562 nm测定96孔板各空的吸光值；根据标准品浓度绘制标准曲线，并计算出样本蛋白浓度，将样本调整为统一标准浓度备用。各组分别取样品15 μL进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；冰浴，30 V，2 h恒压转膜至硝基纤维膜；1×TBS洗膜5 min，2次；用5%Milk-PBST，室温、振荡封闭过夜。分别加入Rabbit-anti-rat UCP2一抗10 μL，Rabbit-anti-rat CREB一抗10 μL，Mouse-anti-rat SIRT1一抗5 μL，4 ℃过夜。TTBS洗膜，5 min，3次；室温下加入小鼠及兔来源的二抗(稀释倍数分别是1∶1 000和1∶500) 摇床孵育2 h；TTBS洗膜5 min，3次。超敏发光液ECL显色，图像分析系统分析，并计算蛋白相对表达量。

1.4 小肠上皮黏膜细胞中CREB、Sirt1 mRNA及线粒体UCP2 mRNA表达检测 采用RT-PCR法。取冻存标本(≤30 mg)，使用眼科剪剪碎小肠组织后，TRIzol法提取组织总RNA，按常规方法反转录合成cDNA，逆转录反应体系：5×Primer Script Buffer，6 μL；Oligo dT Primer(50 μmol/L)，1 μL；Random 6 mers(100 μmol/L)，1 μL；Primer Script RT Enzyme Mix I，1 μL；Total RNA，5 μL；RNase Free Water，总体积加至20 μL。逆转录条件：37 ℃，15 min，85 ℃，5 s。应用Primer 5.0软件，根据被选基因序列设计引物(引物由大连宝生物工程公司合成)，以β-actin作为Real-time PCR的内参照，引物序列：CREB正向引物：5′-CAGATTGCCACATTAGCCC-3′，反向引物：5′-TTCCCTGTTCTTCATTAGACG-3′；Sirt1正向引物：5′-ATGACAGAGCATCACACGCA-3′，反向引物：5′-TGGCTTGAGGATCTGGGAGA-3′；UCP2正向引物：5′-CAAGCGGAGGAAGGAAGG-3′，反向引物：5′-CAATGTTGCCCGAAATGC-3′；β-actin正向引物：5′-TGCCGCATCCCTCTTCCTC-3′，反向引物：5′-CTCCTGCTTGCTGATCCACATC-3′。Real-time PCR反应体系：SYBR Green I，10 μL；Forword primer (10 μmol/L)，0.4 μL；Reverse primer (10 μmol/L)，0.4 μL；DyeⅡ，0.4 μL；模板(cDNA)，2 μL；ddH2O，总体积加至20 μL。反应条件：94 ℃预变性，3 min；94 ℃变性，45 s；56.8 ℃退火，45 s；72 ℃延伸，45 s，共35个循环，72 ℃再延伸7 min终止反应，4 ℃保存。每个反应均设3个复孔，并使用等量的cDNA。相对定量采用ΔΔCT法，首先应分别测定目的基因和参比基因的量，再求出对于参比基因的目的基因相对量，然后再进行样品间相对量的比较。

1.5 小肠上皮组织中ATP含量检测 采用免疫荧光法。按照0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10 μmol/L浓度梯度，将ATP标准溶液用ATP检测裂解液进行相应稀释。在96T板上设置标准品孔、空白孔和样品检测，各孔分别加100 μL ATP检测工作液，室温静置3～5 min，降低本底对实验结果的影响。在各孔内加上20 μL标准品或样品，迅速用微量移液器混匀，至少间隔2 s后，使用多功能酶标仪Luminometer模式，562 nm波长处测定各孔RUL值，通过标准曲线建立回归方程，计算各孔ATP含量。

2 结果

2.1 各组大鼠小肠上皮黏膜细胞CREB、Sirt1及线粒体UCP2蛋白表达比较 见表1。

表1 各组大鼠小肠上皮黏膜细胞CREB、Sirt1和线粒体UCP2蛋白含量比较(n=6)

注：与空白组相比，*P<0.01,**P<0.05,与模型组相比，#P<0.05,##P<0.01；与中药组相比，△P<0.05,△△P<0.01。

2.2 各组大鼠小肠上皮黏膜细胞CREB、Sirt1及线粒体UCP2 mRNA表达比较 见表2。

表2 各组大鼠小肠上皮黏膜细胞CREB、Sirt1和线粒体UCP2 mRNA表达比较(n=10)

注：与空白组相比，*P<0.01；与模型组相比，#P<0.01；与中药组相比，△P<0.05,△△P<0.01。

2.3 各组大鼠小肠组织中ATP含量比较 空白组、模型组、中药组、自愈组大鼠小肠组织中ATP含量分别为(266.38±10.16)、(182.25±11.32)、(249.72±12.68)、(188.65±10.76)nmol/L，与空白组相比，模型组、自愈组大鼠小肠组织中ATP含量降低(P均<0.01)。与模型组相比，中药组大鼠小肠组织中ATP含量升高(P<0.01)；与中药组相比，自愈组大鼠小肠组织中ATP含量降低(P<0.01)。

3 讨论

脾阳虚证常表现为以脾失健运，温煦不足，推动和输布无力所导致的食少纳呆、腹胀或时胀时减、少气懒言、体倦乏力、大便清稀、四肢不温、周身水肿、舌淡苔白、脉弱等临床体征。同时，机体的生理活动依赖于对外界摄取的营养物质消化、吸收、转运和体内的能量代谢过程。如果消化吸收功能障碍，必然导致机体能量合成和代谢紊乱。因此，脾阳虚证的发生可能与小肠消化、吸收和转运营养物质的细胞功能障碍密切相关。

信息沉默调节因子(Sirt1)属于Sirtuin家族，是一种NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶[13]。Sirt1作为核基因参与体内众多生理功能的调节，在糖代谢、脂代谢、胰岛素分泌等过程中发挥重要调节作用。其活化后蛋白通过“核穿梭”进入细胞质中发挥生物学效应。周曦等[14]研究发现，通过活化Sirt1抑制UCP2表达进而减少细胞内ROS的产生可能是细胞抗氧化应激损伤的分子生物学机制之一。Lilia等[7]研究发现，禁食可诱导实验动物肝脏、肌肉、白色脂肪和褐色脂肪组织中Sirt1的表达升高，这一变化由cAMP反应元件结合蛋白(CREB)和碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)协同调控而实现。同时近期研究表明Sirt1蛋白亦存在多种磷酸化位点[15]，其转录和活性亦受到翻译后修饰的调控。因此，Sirt1的活化与CREB表达和磷酸化水平有关，进而调控了UCP2表达而引发相应的生物学效应。

本实验研究结果表明，模型组大鼠小肠黏膜上皮细胞CREB和Sirt1蛋白含量和mRNA表达均低于空白组，差异有统计学意义，而UCP2表达上调，组织中ATP含量减少，提示脾阳虚状态下，由于小肠黏膜上皮细胞CREB蛋白表达下调，使CREB磷酸化活性降低，导致Sirt1蛋白和基因表达抑制，进而导致Sirt1对线粒体UCP2的抑制作用降低，使后者出现过表达而引发线粒体氧化呼吸量解耦联，降低了ATP合成，使小肠上皮细胞的物质转运能力下降。与模型组相比，中药组大鼠小肠黏膜上皮细胞CREB与Sirt1蛋白含量和mRNA表达明显上升，UCP2蛋白表达减少，组织中ATP含量增加，提示附子理中丸治疗脾阳虚证作用可能与改善CREB-Sirt1信号转导通路的活性，下调线粒体UCP2蛋白表达，促进线粒体ATP合成有关。自愈组大鼠小肠黏膜上皮细胞CREB、Sirt1蛋白含量和mRNA表达变化与模型组相似，且明显低于中药组，UCP2表达高于中药组，组织中ATP含量明显低于中药组，提示其由于小肠黏膜上皮细胞CREB-Sirt1信号转导通路的功能抑制而致线粒体UCP2过表达引起ATP合成减少的机制依然存在，导致其宏观表征并未出现明显改观。

脾阳虚状态下，由于小肠组织中CREB-Sirt1信号通路的活性下调，引起线粒体UCP2蛋白表达上调，导致线粒体氧化呼吸链解耦联，引起能量合成障碍，使小肠上皮细胞物质转运功能受抑，进而导致机体营养物质吸收动力不足，表现为脾气虚衰，脾失健运，其运化水谷、转输精微、统摄血液的功能减退，出现食少纳呆、腹胀或时胀时减、少气懒言、体倦乏力之征。因此，小肠上皮细胞CREB-Sirt1介导的UCP2蛋白表达上调和ATP合成减少，参与了脾阳虚消化吸收功能的外周性抑制过程。