枳实含药血清对大鼠胃Cajal间质细胞内质网应激损伤的影响及机制

王远，凌江红，2，张丽敏，谭人千，王煜姣，张钰琴，谢天一，文一惠

(1广西医科大学第一附属医院，南宁 530021；2 上海中医药大学附属曙光医院)

Cajal间质细胞(ICCs)以网状结构广泛分布于人和哺乳动物的胃、小肠、结肠等消化道内，主要有推进电节律传播、转导神经递质信号、起搏平滑肌活动等作用，是调控胃肠动力的重要环节。ICCs细胞内有大量内质网结构，内质网是真核细胞内调节蛋白质合成、合成后加工、折叠和转运及Ca2+储存动态平衡的重要场所，多种内外环境刺激可引起内质网功能紊乱，导致内质网腔内大量未折叠或错误折叠蛋白累积，并引发一系列后续反应称为内质网应激。内质网应激可抑制细胞存活和增殖，并进一步诱导细胞凋亡与自噬。而ICCs数量或结构损伤与诸多胃肠动力障碍疾病的发生密切相关[1]。研究发现，功能性消化不良大鼠胃动力障碍与胃窦组织内质网应激有关[2]。ICCs是胃窦组织内最主要的细胞之一，其损伤或数量异常是胃肠动力障碍发生的关键。枳实可通过上调功能性消化不良大鼠ICCs内c-kit、SCF的表达，促进ICCs的分化增殖，参与调节胃肠活动，具有促进胃动力作用。2017年3～12月，我们基于前期研究的基础，进一步探索枳实含药血清对大鼠胃ICCs内质网应激损伤的影响及机制，为枳实治疗胃肠动力障碍性疾病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：SPF级SD大鼠12只，体质量(250±10)g，由广西医科大学实验动物中心提供，雌雄不限，动物生产许可证号:SCXK 桂 2015-0003。主要试剂：枳实饮片购自广西医科大学第一附属医院中药房；胎牛血清及Ⅱ型胶原酶(Gibco，USA)；M199培养基(Hyclone，USA)；大鼠干细胞因子SCF、Ficoll 400密度梯度液、4-PBA(Sigma)；衣霉素(TM)、青霉素-链霉素-两性霉素B、0.25%胰蛋白酶、PBS(Solarbio)；水合氯醛、戊二醛(Kelong)；CD117/c-kit山羊抗大鼠多克隆抗体、异硫氰酸荧光素(FITC) -山羊抗兔多克隆抗体(Bioss)；TRIzol(Life)；逆转录试剂盒及SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(TaRaKa)。主要仪器：医用超净工作台(Airtech)、CO2培养箱( Thermo Forma)、离心机(Eppendorf)、正置显微镜及倒置相差显微镜(Olympus)、透射电镜(日立)、实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)。

1.2 含药血清制备 根据血清药理学方法[3，4]制备枳实含药血清。取SPF级SD大鼠，雌雄各半。枳实按照普通成人(60 kg/人)临床用量的10倍煎煮药液，以终浓度105%(1.05 g/mL)对大鼠进行灌胃，每组灌胃量均为1.5 mL/100 g，2次/d，连续灌服3 d，采血前禁食不禁水12 h，于末次灌服1 h后，用水合氯醛麻醉大鼠，无菌条件下腹主动脉采血，采用一次性非抗凝真空采血管收集全血，室温静置至血清析出，3 500 r/min离心15 min后分离血清，56 ℃、30 min灭活血清，0.22 μL微孔滤膜过滤除菌，其余放置-80 ℃分装保存。

1.3 ICCs分离、培养 采用酶解法[5]分离培养大鼠胃窦ICCs。取150 g左右的SPF级SD大鼠胃窦组织，置于冰上，用4 ℃预冷PBS冲洗干净后，剥离胃黏膜和胃肌肉层组织，留取肌间层，加入适量M199培养基，用眼科弯剪快速剪碎肌间层组织为约1 mm×1 mm组织块，加入二型胶原酶(浓度为1.3 mg/mL)，于37 ℃恒温水浴锅内消化30 min，消化结束后离心1 200 r/min，共5 min；弃上清，加入M199培养基终止消化，离心1 200 r/min,共5 min；弃上清，再次加入M199培养基匀速吹打300次，过200目筛网去除大块组织，将过滤后的细胞悬液收集于离心管内，加入等量Ficoll400密度梯度液，1 900 r/min离心15 min，取交界面细胞，加入完全培养基(含10%胎牛血清、2%青霉素-链霉素-两性霉素B溶液和25 ng/mL干细胞因子)重悬细胞并转移至培养瓶，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱培养，6～8 h细胞贴壁后换液，结合细胞生长情况，每2 d换液1次。

1.4 ICCs的免疫荧光鉴定 采用c-kit免疫荧光染色法鉴定ICCs。取原代培养3～5 d的ICCs，用0.25%胰蛋白酶将细胞消化下来，加入适量完全培养基后离心(800 r/min，共5 min)，弃上清，再加完全培养基吹打、重悬，将细胞密度调整为1×104/mL后接种于含有细胞爬片的无菌24孔板。经稳定培养24 h后，弃掉原有培养基，PBS轻柔冲洗2次，按照以下步骤进行c-kit免疫荧光染色：①用4%甲醛固定爬片细胞，10 min；②PBS冲洗3次，每次3 min，用0.5%TritonX-100(PBS配制)室温通透10 min；③PBS冲洗3次，每次3 min，用5%山羊血清室温封闭1 h；④将c-kit抗体按1∶100稀释，置于湿盒内与细胞爬片共孵，4 ℃，过夜；⑤避光，加入FITC标记羊抗鼠的IgG(1∶200)室温孵育1 h；⑥滴加抗猝灭封片液封片，荧光显微镜下观察并采集图像。

1.5 细胞分组与干预 采用内质网应激诱导剂Tm刺激ICCs构建ERS模型。结合相关文献[6，7]提示，予浓度为1 μg/mL的Tm作用于细胞24 h以诱导细胞ERS。取对数生长期ICCs随机分为四组：ICCs组加入完全培养基正常培养；ERS模型组于完全培养液中加入Tm处理，使Tm终浓度达到1 μg/mL；抑制剂组于完全培养液中加入终浓度为1 μg/mL TM和10 mmol/L 4-PBA联合作用；枳实组于完全培养液中加入终浓度为1 μg/mL TM和20%枳实含药血清联合作用。各组加药后继续作用24 h，分别收集各组细胞用于后续实验。

1.6 ICCs内质网超微结构观察 各组细胞干预24 h后，分别收集所有细胞。各组分别加入2.5%戊二醛，4 ℃固定2 h。PBS浸洗3次，每次5 min。再加入2%四氧化锇缓冲固定液后固定，4 ℃固定3 h。PBS冲洗3次，每次5 min。用30%-50%-70%-90%-95%-100%乙醇对样品进行梯度脱水，每步5 min，其中100%乙醇重复3次。加入丙酮以置换样品中乙醇，每次10 min，重复3次；然后将环氧树脂与固化剂按以下比例混合并充分搅拌进行渗透：丙酮∶环氧树脂=3∶1，室温作用3 h；丙酮∶环氧树脂=1∶1，室温作用3 h；丙酮∶环氧树脂=1∶3，室温过夜；环氧树脂，室温作用24 h。按2%比例向环氧树脂中加入催化剂混匀后进行包埋，逐次经35 ℃、12 h，45 ℃、12 h，最后60 ℃、24 h烘箱中聚合。超薄切片及常规电镜染色。在透射电镜下观察各组ICCs内质网超微结构，并采集图像。

1.7 葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、激活转录因子6(ATF6)mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。GRP78、ATF6基因序列均从GenBank中获取。GAPDH正向引物：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′,反向引物：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′；GRP78正向引物：5′-TCAGCCCACCGTAACAATCAAG-3′，反向引物：5′-TCCAGTCAGATCAAATGTACCCAGA-3′；ATF6正向引物：5′-ATCACCTGCTATTACCAGCTACCAC-3′，反向引物：5′-TGACCTGACAGTCAATCTGCATC-3′。TRIzol法提取ICCs细胞总RNA，用紫外分光光度计测定样品RNA纯度，A260/A280值为1.8～2.0用于检测，按照试剂盒说明书，取RNA进行逆转录合成cDNA，以此cDNA为模板，GAPDH基因为内参对照，进行PCR扩增GRP78、ATF6基因。PCR扩增的反应体系为SYBR Preminx Ex TaqⅡ(2*) 10 μL，引物各0.8 μL，样本溶液2.0 μL，ROX Reference DyeⅡ(50*) 0.4 μL，加无酶水至20 μL总体积。将配好的PCR反应溶液置于7500 Fast Real Time PCR仪上进行Real Time PCR扩增反应：95 ℃ 30 s 1个循环；95 ℃ 3 s、60 ℃ 30 s 40个循环；生成标准曲线、扩增曲线，计算机分析循环阈(Ct)值。每个样品设立3个复孔，采用2-ΔΔCt法计算各组mRNA的相对表达量。

2 结果

2.1 ICCs光镜下形态及免疫荧光鉴定 对数生长期ICCs在光镜下细胞呈梭形、三角形、星型等，伴有细长的分枝状突起，细胞质较少，胞核大，与周围细胞间形成突触链接。倒置荧光显微镜下，ICCs免疫荧光鉴定c-kit呈阳性表达，c-kit是ICCs的特异性标记，说明该细胞即为ICCs。

2.2 ICCs透射电镜下内质网形态 正常组ICCs内可见内质网形态完整、排列整齐； ERS模型组ICCs内质网肿胀、扩张、呈囊泡化、相互离散及脱颗粒改变，内质网结构破坏明显；抑制剂组ICCs内质网断裂、呈囊泡化改变；枳实组ICCs内质网肿胀，呈局限性扩张。

2.3 各组GRP78、ATF6 mRNA表达比较 见表1。

表1 各组GRP78、ATF6 mRNA表达比较(n=6,±s)

注：与空白组相比，*P<0.05；与ERS模型组相比，#P<0.05；与抑制剂组相比，△P<0.05。

3 讨论

枳实味苦、辛、酸，归脾、胃经，具有破气消积、化痰散痞的功效，对食积停滞、痞满胀痛、大便不通等胃肠疾病有较好治疗效果[8]。现代研究表明，枳实及其有效活性成分可参与调节胃肠动力，改善胃肠道动力障碍[9]。胃肠道动力障碍的形成原因复杂，机制尚未阐明。目前普遍认为，ICCs在胃肠动力障碍性疾病的发生及进展过程中有重要作用，此与ICCs的生理特性密切相关，ICCs可起搏并传播胃肠道慢波电位，参与调节胃肠平滑肌的自发节律性收缩运动；且细胞膜上表达多种神经递质受体，介导胃肠神经系统与平滑肌细胞间的神经信号传导，进而调节胃肠平滑肌舒缩功能。多种胃肠道动力障碍性疾病，如贲门失弛缓症[10]、糖尿病性胃肠病[11]、慢性假性肠梗阻[12]、慢性传输型便秘[13]等，与ICCs网络受损、缺失或异常等病理损害密切相关。因此减轻各种应激刺激导致的ICCs细胞损伤，对改善消化道动力有重要意义。

内质网是真核细胞内重要的亚细胞结构，其内环境稳定是细胞功能正常发挥的基本条件之一。多种内外环境刺激，如氧化应激、炎症激刺、细胞内Ca2+平衡紊乱等均能破坏内质网稳态，引发内质网应激反应。此时内质网迅即启动未折叠蛋白反应(UPR)，位于细胞内质网上的分子伴侣GRP78被激活，转而结合内质网中不断增多的未折叠或错误折叠蛋白，因此GRP78的大量表达被认为是发生内质网应激反应的标志。当内质网腔内未折叠蛋白持续增多，超出内质网负荷时，可造成细胞损伤或发生内质网相关性凋亡，影响细胞功能的正常发挥及存活结局[14]。本实验结果表明，采用Tm诱导ICCs内质网应激反应，ERS模型组ICCs内质网出现肿胀、扩张、相互离散、囊泡化及脱颗粒等病理形态改变，且ERS模型组GRP78 mRNA表达相较于ICCs组升高，差异有统计学意义，表明ERS模型成立，ICCs出现内质网应激相关性损伤。枳实组ICCs内质网出现轻度肿胀、局限性扩张；与ERS模型组相比，枳实组GRP78 mRNA表达降低，表明枳实能缓解ICCs内质网应激反应，减轻ICCs内质网损伤。

ATF6是定位于内质网膜的一个重要感受蛋白，发生内质网应激时，GRP78优先与错误折叠蛋白结合并释放ATF6，进而激活其下游信号分子，参与介导细胞凋亡[15]。活化的ATF6进入高尔基体被蛋白酶S1P和S2P剪切，释放含bZIP结构域的活性转录因子ATF6(N)进入细胞核，激活GRP78等多种内质网应激相关基因的转录与表达[16]，以应对不良微环境。已有研究证实，ATF6通路参与多种疾病的发生及进展过程[17]；且内质网应激可诱导细胞发生自噬与凋亡，将高表达的ATF6瞬时转染HepG2细胞则可使细胞自噬率和凋亡率显著增加。由此说明，ATF6高表达可促进内质网应激引起的自噬和凋亡。本研究表明，与ICCs组比较，ERS模型组ATF6 mRNA表达升高，差异有统计学意义，ATF6大量蓄积；与ERS模型组相比，枳实组ATF6 mRNA表达降低，表明枳实能减少ATF6蓄积，有助于修复ICCs内质网稳态，减轻内质网应激导致的ICCs损伤。

综上所述，枳实可减轻ICCs内质网应激损伤，其作用机制可能与调控ATF6信号通路有关。