miR-125b在鼻息肉上皮细胞中的表达及意义

杨琳红，王维峰，张淑红，范宗宪，魏晓丽，李江华

(1佳木斯大学附属第一医院,黑龙江佳木斯 154000;2佳木斯大学基础医学院)

鼻息肉是耳鼻喉科常见的鼻腔良性增生性病变，目前，手术切除仍是鼻息肉的主要治疗手段，然而高达15%～40%的患者存在术后复发[1]。鼻息肉的形成机制错综复杂，大量研究结果显示，鼻息肉形成与炎症反应、细胞因子、变态反应、免疫应答及环境因素等密切相关[2]。近年来，鼻黏膜上皮细胞的细胞增殖与凋亡在鼻息肉形成和发展中的作用，逐渐成为研究热点。微小RNA(microRNAs)是由18～25个核苷酸组成的非编码小RNA分子，参与调节多种机体生理病理过程，如胚胎发育、新陈代谢、免疫应答及肿瘤形成和发展等[3]。microRNAs具有作为疾病诊断标志物及治疗靶点的潜能[4]，如miR-125b在喉鳞状细胞癌中表达降低，且参与细胞增殖和迁移过程，可作为治疗靶标[5]；而在HER2阳性乳腺癌中，miR-125b表达升高，且其高表达预示患者不良预后[6]。目前关于miR-125b功能的研究结论不一。2016年1～12月，我们研究miR-125b在鼻息肉上皮细胞中表达对细胞增殖、凋亡的影响，并初步探讨其机制，以期为鼻息肉的早期干预及治疗提供理论基础和新思路。

1 材料与方法

1.1 标本、试剂与仪器 收集2016年1～12月入住佳木斯大学附属第一医院的30例鼻息肉患者的鼻息肉样本，患者男19例、女11例，年龄16～55(41.36±5.59)岁。纳入标准：首次鼻息肉切除术；术前2周未使用糖皮质激素、抗组胺药物。选择同期行单纯鼻中隔矫正手术的16例患者的正常下鼻甲样本，患者男9例、女7例，年龄15～43(27.68±4.67)岁，两组性别、年龄间差异无统计学意义，具有可比性。样本采集经患者知情同意，本研究经医院伦理委员会审核通过。试剂：胶原酶Ⅳ、DMEM/F12培养液、胎牛血清、双抗溶液(青霉素+链霉素)和0.25%胰酶溶液均购自美国Gibco公司，TRIzol溶液、RNA反转录试剂盒和real-time PCR试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司，real-time PCR引物、miR-125b mimics和无关对照序列均由上海生工生物工程股份有限公司合成，Lipofectamine®3000购自美国Invitrogen公司，CCK-8试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，RIPA裂解液、BCA试剂盒和ECL发光液购自上海碧云天生物技术有限公司，抗体PI3KCD(ab151549)、Akt(ab64148)、p-Akt(ab18785)和GAPDH(ab9485)均购自美国Abcam公司，HRP标记的二抗购自艾美捷科技有限公司。仪器：二氧化碳细胞培养箱(美国Thermo HERAcell 150i/240i)，低温离心机(美国Thermo Scientific Fresco 17)，微量组织研磨器(美国Kimble 749540-0000)，超微量分光光度计(美国Thermo Scientific NanoDrop 2000C)，定量PCR仪(美国Applied Biosystems 7500)，酶标仪(美国BioTek ELx800)，流式细胞仪(美国BD FACSCanto Ⅱ)。

1.2 细胞原代培养 术中切取鼻息肉，预冷无菌PBS缓冲液反复冲洗；无菌剪将组织剪碎后，加入适量1%胶原酶Ⅳ，吹打后，置于二氧化碳细胞培养箱中消化30 min；吹打消化后的组织，弃去块状组织；4 ℃，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入DMEM/F12培养液(含10%胎牛血清，100 U/L青霉素和100 ng/mL链霉素)，吹打混匀后，接种于培养皿中，置于二氧化碳细胞培养箱中。

1.3 鼻息肉及下鼻甲组织中miR-125b相对表达量检测 采用荧光定量PCR法。取鼻息肉和下鼻甲组织，切取适量，按100 mg/mL加入TRIzol溶液，微量组织研磨器进行充分匀浆，参照TRIzol法提取RNA试验步骤，提取组织样本中总RNA，超微量分光光度计测定RNA浓度和纯度后，取0.8 μg RNA，参照RNA反转录试剂盒的反应体系(20 μL体系)和反应条件，将RNA反转录为cDNA，参照real-time PCR试剂盒的反应体系和反应条件(95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循环35次)，定量PCR仪进行检测。real-time PCR引物序列如下，miR-125b正向引物：5′-GCUCCCUGAGACCCUAAC-3′,反向引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′，以U6为内参，采用相对定量法计算miR-125b相对表达量。

1.4 细胞分组及转染 鼻息肉上皮细胞培养于DMEM/F12培养液中，呈贴壁生长，处于对数生长期的细胞，随机分为mimics组、NC组和空白对照组，mimics组、NC组采用脂质体转染试剂Lipofectamine®3000分别将miR-125b模拟物(miR-125b mimics)和无关对照序列(NC)转染至细胞中，空白对照组未进行转染，转染4～6 h后，更换培养液。

1.5 细胞增殖能力检测 细胞转染试验12 h后，0.25%胰酶消化，制备细胞悬液，接种于96孔板中(约8×104个细胞/100 μL/孔)，每组设置6个复孔，0、24、48、72 h时，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培养箱中孵育4 h后，酶标仪450 nm处检测吸光度值。独立重复试验3次，取平均值进行统计分析。

1.6 细胞凋亡率测算 细胞转染48 h后，0.25%胰酶(不含EDTA)消化，预冷PBS缓冲液洗涤2次，制备细胞悬液，调整细胞密度为1×107/mL，取细胞悬液100 μL，加入PI 5 μL和Annexin V-FITC染料5 μL，轻轻吹打混匀后，避光室温孵育15 min，加入Binding Buffer 400 μL，流式细胞仪进行检测。独立重复试验3次，取平均值进行统计分析。

1.7 鼻息肉上皮细胞中PI3KCD、Akt、p-Akt蛋白表达检测 细胞转染后48 h后，收集约1×106个细胞，RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，取20 μg蛋白，加入相应体积上样缓冲液，沸水煮沸变性5 min，SDS-PAGE胶分离后，湿转法将蛋白转至PVDF膜，5% BSA溶液(PBS缓冲液溶液配制)室温孵育1 h后，分别加入PI3KCD、Akt、p-Akt和GAPDH一抗工作液(PBS缓冲液溶液配制，稀释比例均为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，PBST溶液(0.1%)洗涤3次后，分别加入对应的HRP标记的二抗工作液(PBS缓冲液溶液配制，稀释比例均为1∶5 000)，室温孵育1 h，PBST溶液(0.1%)洗涤3次后，ECL发光液进行显色反应，以目的基因条带与内参GAPDH条带的灰度值的比值，表示目的基因的蛋白相对表达量。独立重复试验3次，取平均值进行统计分析。

2 结果

2.1 miR-125b在鼻息肉及正常下鼻甲组织中表达比较 miR-125b在鼻息肉、正常下鼻甲样本中的相对表达量分别为0.39±0.12、1.16±0.24，二者比较差异有统计学意义(t=-9.700，P=0.000)。

2.2 miR-125b过表达对鼻息肉上皮细胞增殖的影响 CCK-8试验结果显示，细胞转染24 h后，mimics组细胞增殖能力与NC组和空白对照组之间差异无统计学意义；细胞转染48 h后，mimics组细胞增殖能力低于NC组(t=-4.374，P=0.006)和空白对照组(t=-4.014，P=0.008)，NC组和空白对照组间差异无统计学意义(t=-0.244，P=0.410)；细胞转染72 h后，mimics组细胞增殖能力低于NC组(t=-2.540，P=0.032)和空白对照组(t=-2.739，P=0.026)，NC组和空白对照组间差异无统计学意义(t=-0.294，P=0.392)，见表1。

表1 各组细胞不同时间点的吸光度值比较±s)

注：与同时点NC组和空白对照组相比，*P<0.05。

2.3 miR-125b过表达对鼻息肉上皮细胞凋亡的影响 流式细胞术结果显示，细胞转染48 h后，mimics组、NC组、空白对照组细胞凋亡率分别为21.35%±2.65%、9.16%±1.88%、8.95%±2.04%，mimics组与NC组、空白对照组比较差异有统计学意义(t=6.498，P=0.001；t=6.422，P=0.002)，NC组和空白对照组比较差异无统计学意义(t=0.131，P=0.451)。

2.4 各组细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白的相对表达量比较 mimics组细胞中PI3KCD蛋白相对表达量均低于NC组和空白对照组(t=-7.464，P=0.001；t=-7.710，P=0.001)，NC组和空白对照组比较差异无统计学意义(t=1.008，P=0.185)；mimics组细胞中p-Akt蛋白相对表达量均低于NC组和空白对照组(t=-5.035，P=0.004；t=-4.181，P=0.007)，NC组和空白对照组比较差异无统计学意义(t=0.500，P=2.132)，见表2。

表2 各组细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白的相对表达量比较±s)

注：与NC组和空白对照组相比，*P<0.05。

3 讨论

鼻息肉是一种特殊类型的慢性鼻-鼻窦炎，又名为慢性鼻-鼻窦炎伴息肉，以鼻黏膜在鼻窦和鼻腔形成息肉为主要特点，是临床常见的鼻腔和鼻窦黏膜的慢性炎症性疾病[7]。流行病学调查统计结果显示，我国一般人群中鼻息肉的发病率约4%，且复发率高，严重影响患者生活质量[8]。目前，鼻息肉的形成机制尚无统一认识，近年来有研究报道称，在鼻息肉形成过程中，局部鼻黏膜上皮细胞受到多种内在及外在病理因素的长期刺激，引起细胞纤维化、水肿及异常增殖，进而导致上皮细胞受损及组织异常重塑，形成鼻息肉[9]。细胞增殖和凋亡是维持内环境平衡的关键，是生物体重要的生命特征。鼻息肉作为一种炎性增生型疾病，上皮细胞的增殖和凋亡平衡失调可能是导致鼻息肉形成及复发的关键。鼻息肉具有可增殖复发但无癌变的特征，目前，关于促癌基因与抑癌基因、增殖与凋亡基因在鼻息肉等炎性增生型疾病中研究日益增多[10]。

研究证实，miR-125b可同时具有抑癌基因和促癌基因功能，如在急性髓系白血病中，miR-125b具有抑癌基因功能，可抑制细胞增殖侵袭、促进细胞凋亡[11]，而在非小细胞肺癌中，miR-125b则发挥促癌基因功能，其高表达可促进细胞侵袭并导致患者预后不良[12]。本研究结果发现，miR-125b在鼻息肉样本中的相对表达量低于正常下鼻甲样本，差异有统计学意义，提示在鼻息肉形成过程中miR-125b可能发挥抑制作用。随后，采用细胞转染试验，在鼻息肉上皮细胞中过表达miR-125b后发现，细胞增殖被显著抑制，且细胞凋亡明显增加，提示miR-125b高表达具有促进细胞凋亡、抑制细胞增殖作用，而miR-125b在鼻息肉中表达降低，由此推测，miR-125b低表达可能通过增强细胞增殖、抑制细胞凋亡，进而促进鼻息肉形成。陈丹等[13]研究结果亦证实，在鼻息肉形成、生长、新腺体形成等过程中，鼻黏膜上皮细胞过度增殖及凋亡减少发挥了重要作用。

本研究发现，增加鼻息肉上皮细胞中miR-125b表达后，细胞中PI3KCD蛋白水平降低，PI3KCD(即PI3K delta亚基)是PI3K的重要亚基，在肿瘤细胞的多种生物学过程中发挥重要功能[14]。PI3K活化后可催化磷酸化磷脂酰肌醇4，5-双磷酸(PIP2)磷酸化为PIP3，进而激活Akt及其下游信号转导。本研究中增加鼻息肉上皮细胞中miR-125b表达后，细胞中p-Akt蛋白水平降低，提示过表达miR-125b可抑制PI3K/Akt信号通路活性，miR-125b是PI3K/Akt信号通路活性的负性调节因子。Cui等[15]研究结果证实，miR-125b通过靶向调节PI3KCD基因表达，抑制宫颈癌细胞增殖、诱导细胞凋亡。PI3K/Akt信号通路在细胞增殖、凋亡、转移和黏附等生物过程中均占重要地位[16]，本研究并未对miR-125b调控PI3K/Akt信号通路活性的作用机制进行深入研究，后续将进一步探究。此外，研究证实，鼻息肉形成与发展过程中存在多种细胞增殖、凋亡基因的异常表达，如Fas/FasL[17]、Bax/Bcl-2[18]及Ki-67[19]等。本研究将在后续研究中关注其他增殖、凋亡基因在鼻息肉上皮组织中的表达及机制。

综上所述，miR-125b在鼻息肉中低表达，其可能通过调节PI3K/Akt信号通路活性，促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，进而在鼻息肉形成与发展过程中发挥促进作用。