原发性肝细胞癌组织中Tenascin-C蛋白表达及意义

田艳红，王宏利，郭雅玲，罗改云，高秀梅，阚洪敏

(西安市第八医院，西安 710061)

据统计，我国因恶性肿瘤死亡的人数约占全部死亡人数的1/4[1]，其中肝癌高居发病率的第四位、死因的第三位[2]。依据细胞分型，可将原发性肝癌分为肝细胞癌(HCC)、肝内胆管细胞癌及混合型肝癌，其中以HCC最为常见[3]。影响HCC患者预后的主要因素之一是肿瘤细胞对其他机体组织的侵袭与转移。目前针对HCC肿瘤细胞的侵袭与转移过程的研究主要集中于肿瘤细胞本身，而对细胞外基质研究较少。肌腱蛋白家族的主要成员Tenascin-C蛋白，是一种由TNC基因编码的六聚体糖蛋白，主要表达于多种机体组织的细胞外基质中[4]。Tenascin-C蛋白参与调控细胞-细胞、细胞-细胞外基质间的相互作用[5]，有可能参与HCC的发生和恶性进展过程。2013年1月～2018年3月，我们应用免疫组化法检测Tenascin-C蛋白在HCC患者癌组织中的表达，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年1月～2018年3月我院HCC患者60例，男41例、女19例，年龄25～76(49.32±12.44)岁。患者均于术后经病理科确诊为原发性HCC。纳入标准：①原发性HCC，未合并其他种类恶性肿瘤；②患者临床病例资料完整；③术前未进行放、化疗等其他抗肿瘤手段治疗；④未合并其他严重疾病。HCC组织标本由外科手术取得，均立即常规石蜡包埋储存。另选取30例肝硬化组织[肝硬化患者，男19例、女11例，年龄27～74(45.41±10.57)岁，经肝穿刺活检确诊]和15例正常肝组织作为对照[健康志愿者，男9例、女6例，年龄24～72(47.32±11.18)岁]。本研究经医院伦理委员会批准，患者及家属知情同意。

1.2 肝癌、肝硬化及正常肝组织中Tenascin-C蛋白表达检测 采用免疫组化法。将石蜡标本常规脱蜡水化，以4 μm间隔连续切片，于95 ℃沸水浴20 min修复抗原，室温冲洗30 min冷却至室温，PBS冲洗3次。滴加去离子水孵育10 min，PBS冲洗3次。以常规山羊血清工作液封闭，孵育15 min。加入一抗Tenascin鼠抗人单克隆抗体(PL Laboratories公司，加拿大)，置于4 ℃冰箱过夜孵育。次日恢复至室温后加入生物素化小鼠二抗(购于深圳欣博盛生物科技有限公司)孵育15 min，PBS冲洗3次。滴加辣根过氧化物酶亲和素(购于深圳欣博盛生物科技有限公司)，孵育15 min，PBS冲洗3次。DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水。常规制片，封片。高倍(×400)光学显微镜下取4个不同阳性区域，观察Tenascin-C蛋白表达情况。采用半定量法判定结果，取4个区域结果的算术平均数。将染色结果分为两部分：染色强度判定：无色计0分，浅黄色至黄色计1分，棕黄色计2分，褐色计3分；染色数目判定：<5%计0分，5～30%计1分，30～75%计2分，>75%计3分。将染色结果与染色数目相加，0～3分视为阴性表达，>3分视为阳性表达。

1.3 随访 以患者术后出院为观察起点，应用电话、电子通讯等手段，结合复诊病历，对患者进行随访调查。随访截止于2018年3月，时长9～62(31.02±13.70)个月。失访病例已剔除。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。组间比较采用χ2检验和t检验，预后分析采用Kaplan-Meier生存曲线法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同肝组织中Tenascin-C蛋白表达比较 Tenascin-C蛋白在HCC癌组织、肝硬化组织和正常肝组织中的阳性表达率分别为61.67%(37/60)、20.00%(6/30)、0(0/15)，三者比较差异有统计学意义(χ2=26.496，P=0.000)。

2.2 癌组织中Tenascin-C表达与HCC患者临床病理特征的关系 HCC癌组织中Tenascin-C表达与门静脉侵犯、TNM分期和淋巴结转移相关(P均<0.05)，与患者性别、年龄和肿瘤直径无关(P均>0.05)，见表1。

表1 Tenascin-C表达与HCC患者临床病理特征的关系

2.3 HCC癌组织中Tenascin-C表达对患者预后的影响 Tenascin-C表达阴性者生存率为56.52%(13/23)，生存时间为(45.64±3.91)个月；Tenascin-C表达阳性者生存率为16.22%(6/37)，生存时间为(28.58±2.36)个月。Tenascin-C阴性表达者的术后生存率和生存时间均优于Tenascin-C阳性表达者(χ2=10.648，P=0.001；t=21.118，P=0.000)。

3 讨论

HCC起病初期无明显症状，一旦出现肝区肿大、肝区疼痛及其他明显全身性症状时，则多数已进入中晚期。目前我国临床对HCC可采取的治疗措施有根治性肝切除术、介入治疗、中医中药治疗、放射治疗、化疗、消融治疗、靶向治疗等[6]。HCC的5年总生存率约20%[7]。一般认为接受根治性手术的HCC患者预后瓶颈在于HCC转移与复发[8]，但目前尚无有效预防HCC术后转移与复发的手段。肿瘤的转移、复发与肿瘤细胞及其附近的细胞外基质所形成的微环境密切相关[9]。肿瘤细胞外基质有其特殊性，其中的基质细胞与自身的产物具有刺激肿瘤血管生成、增加肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞侵袭及转移等作用[10]。

Tenascin-C蛋白是一种广泛表达的细胞外基质相关蛋白，有可能参与肿瘤细胞的侵袭与转移，但目前对于Tenascin-C蛋白在HCC组织中的作用的研究尚不明确。Tenascin-C蛋白的6个亚基由二硫键连接，每个亚基均含有一个富含半胱氨酸端，表皮生长因子基团，纤维连接蛋白Ⅲ型结构域及一个类纤维蛋白原C基末端[11]，从而形成一种多域结构。Tenascin-C蛋白的多域结构使其能与多种蛋白发生相互作用，从而参与机体内的细胞增殖、黏附、迁移与分化[12]。Tenascin-C蛋白在胎儿的正常发育过程中表达较高，在胚胎成型过程中起重要作用[13]。Tenascin-C蛋白在正常的成熟组织中表达较低，而Tenascin-C表达上调多提示感染、炎症甚至肿瘤等病理进程的出现[14]。近期，Wang等[15]通过研究动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的Tenascin-C表达发现，Tenascin-C能通过annexin Ⅱ蛋白调节巨噬细胞的免疫表型，同时促血管生成。Murakami等[16]通过检测大肠癌基质中Tenascin-C表达发现，Tenascin-C在大肠癌基质中的表达升高，且可能是部分微小RNA的作用靶点，从而参与大肠癌的肝转移进程。San等[17]发现，骨内膜细胞基质中Tenascin-C表达与前列腺癌的骨转移密切相关。

本研究发现Tenascin-C在正常肝组织中未出现阳性表达，而在HCC组织中异常高表达，而肝硬化组织中Tenascin-C表达虽较HCC组织低，仍较正常肝组织有所升高。因此推断肝组织中Tenascin-C表达与前述其他组织中相似，即肝组织中Tenascin-C表达异常可提示机体肝脏出现炎症、感染、肿瘤等异常情况，Tenascin-C可能参与了肝组织中多种异常病理进程。本研究结果显示，HCC组织中Tenascin-C表达与门静脉侵犯、肿瘤分期和淋巴结转移相关，提示Tenascin-C在HCC组织中所起作用与前述肿瘤相关研究类似，即Tenascin-C能增强肿瘤细胞的侵袭力，提高肿瘤发生转移的可能。对术后患者的随访调查结果显示，Tenascin-C表达阳性者普遍预后较差，5年总生存率不足20%，因而可将Tenascin-C表达阳性视为HCC患者不良预后的标志。

综上所述，Tenascin-C在HCC组织中的表达异常升高，Tenascin-C可能参与了HCC的发生和恶性进展。Tenascin-C表达阳性者预后较差，需加强监控，术后合理结合辅助抗肿瘤手段，以延长患者生存时间，提高生存率。