肝细胞癌患者血清中miR-7、硒蛋白P水平变化及意义

谭华梁，肖麟，王小娟，蒋士生

(1 湖南中医药大学，长沙 410007；2 湖南中医药大学第一附属医院；3 湖南中医药研究院)

肝细胞癌(HCC)是一种原发性肝癌，是世界范围内第三大导致癌症相关死亡的主要原因，HCC高病死率主要归因于缺乏早期特异性诊断标志物[1,2]。miR-7是microRNA家族成员，已被证实通过调控PI3K/AKT等多种信号通路参与肿瘤发生发展过程，并影响肿瘤化疗敏感性，体外实验证实，miR-7可抑制喉鳞癌、乳腺癌等癌细胞增殖和迁移[3～5]。硒蛋白P(SeP)是一种富含硒的糖蛋白，血浆中SeP主要由肝脏产生，起抗氧化损伤作用，在促进肿瘤细胞凋亡、抗肿瘤发展中发挥重要作用[6]。Dewing等[7]研究表明，SeP是miR-7的特异性靶点。目前，HCC患者血清miR-7和SeP水平变化及意义尚未明确。2015年3月～2018年3月，我们检测了HCC患者血清中miR-7和SeP水平，探讨其在HCC早期诊断中的意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年3月～2018年3月于湖南中医药大学第一附属医院首次确诊为HCC的57例患者作为病例组，经影像学、血清学等检查符合 ESMO-ESDO临床实践指南中HCC诊断标准，并经病理学确诊[8]，其中男36例、女21例，年龄41～76(60.35±11.47)岁。排除接受过化疗、放疗等癌症辅助治疗；合并其他脏器肿瘤患者；患有神经系统、免疫系统及血液系统疾病；合并全身炎症性疾病，使用过非甾体类抗炎药；临床资料缺失者。

另选择同时期体检身体均健康的50例健康者作为对照组，无肿瘤相关病史及家族史，其中男27例、女23例，年龄40～80(62.41±12.58)岁。病例组和对照组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义。所有受试者对本研究知情并自愿参与；本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 HCC患者血清miR-7和SeP检测方法 病例组患者入院后未治疗前采集空腹肘静脉血，对照组体检当日采集肘静脉血，低温离心，分离血清保存。①采用TRIzol®试剂提取血清总RNA，SuperScript Ⅳ逆转录酶进行逆转录反应，获得模板cDNA，使用Fast SYBR®Green Master Mix进行实时荧光定量PCR(RT-PCR)，以U6为内参，检测血清中miR-7相对表达量。miR-7正向引物：5′-AAAGAACATCCAGGCAAATGTGA-3′，反向引物：5′-CCGCCTAACGTACGCGCATATT-3′；U6正向引物：5′-CTGCGAAGCCGTGCTCA-3′，反向引物：5′-AGCGTTGAGCAATTAGCGT-3′。实验过程中试剂均购于美国Thermo Fisher公司，引物合成于上海生工生物工程有限公司。②采用ELISA试剂盒(南京金益柏生物科技有限公司)检测两组血清SeP水平。

2 结果

2.1 两组血清miR-7和SeP水平比较 病例组、对照组血清miR-7相对表达量分别为0.52±0.16、1.18±0.43，两组比较差异有统计学意义(t=10.775，P=0.000)；病例组、对照组血清SeP水平分别为(2.49±0.71)、(4.54±1.12)mg/L,两组比较差异有统计学意义(t=11.447，P=0.000)。

2.2 病例组血清miR-7和SeP的关系 病例组血清miR-7水平与SeP水平呈正相关(r=0.487，P=0.013)。

2.3 血清miR-7和SeP水平与HCC患者临床病理特征的关系 肿瘤个数>1个患者血清miR-7相对表达量低于肿瘤个数1个患者(P<0.05)；肿瘤直径≥5 cm患者血清miR-7相对表达量低于<5 cm患者(P<0.05)；血清miR-7相对表达量在不同分化程度、TNM分期及脉管是否侵犯方面差异无统计学意义(P均>0.05)；肿瘤直径≥5 cm患者血清SeP水平低于<5 cm患者(P<0.05)；血清SeP水平在不同肿瘤个数、分化程度、TNM分期及脉管是否侵犯方面差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 血清miR-7和SeP水平与HCC患者临床病理特征的关系±s)

2.4 血清miR-7和SeP对HCC的诊断价值 血清miR-7单独检测诊断HCC的ROC曲线下面积(AUC)为0.830，95%CI为0.745～0.896，P<0.000 1；当血清miR-7表达量≤0.62时，其诊断敏感度为75.44%，特异度为84.00%。血清SeP单独检测诊断HCC的AUC为0.934，95%CI为0.869～0.973，P<0.000 1；当血清SeP水平≤3.24时，其诊断敏感度为80.70%，特异度为92.00%。血清miR-7联合SeP检测诊断HCC的AUC为0.966，95%CI为0.912～0.992，P<0.000 1；其诊断敏感度为89.47%，特异度为96.00 %。血清miR-7联合SeP诊断HCC的效能最高。

3 讨论

近年来，miRNA已成为一类新的潜在诊断生物标志物，在癌症检测中具有高度准确性[9]。miR-7是一类在不同物种间高度保守的miRNA分子，可通过多个靶基因在多种信号途径中发挥调控作用[10]。研究报道，miR-7在肺癌中表达下调，而过表达miR-7可通过下调CGG结合蛋白(CGGBP1)表达，抑制体外肺癌细胞增殖和生长[11]。Xie等[12]研究报道，miR-7可通过靶向表皮生长因子受体(EGFR)抑制胃癌细胞的侵袭转移。以上研究结果证实miR-7在肿瘤进展中的潜在作用。本研究结果显示，HCC患者血清中miR-7相对表达量低于对照组，差异有统计学意义，与肺癌、胃癌中研究结果一致，分析发现，miR-7表达与HCC患者肿瘤个数及直径有关，提示miR-7在HCC中失调可能与肿瘤增殖及生长有关。刘晓智等[13]研究表明，叶酸/聚酰胺-胺介导miR-7治疗小鼠胶质瘤，胶质瘤细胞凋亡率明显增加，提示叶酸/聚酰胺-胺介导miR-7可能是胶质瘤新的有效基因治疗方法。另有研究报道，雄激素受体介导的miR-7在前列腺癌去势治疗中发挥积极作用[14]。以上研究结果提示通过干预miR-7表达可能对肿瘤治疗起积极作用。但miR-7对HCC癌细胞的作用尚需进行体外实验验证。

硒是人体必需的一种微量元素，具有增强人体免疫力、保护心肌、促进脑发育及预防癌症发生、诱导癌细胞凋亡等作用，在血浆中主要以含硒代半胱氨酸的SeP存在[15]。血浆中SeP可通过消除氧自由基，激活p53基因，防止DNA发生氧化损伤并具有修复基因功能，从而防止基因突变发挥抗肿瘤作用[16]。动物实验表明，对原发性、继发性及转移等产生的恶性肿瘤，给予适量硒补充均能降低肿瘤生长率和晚期临床分期[17]。田志帅等[18]研究表明，SeP在直肠癌中低表达，与肿瘤直径、浸润浆膜有关，提示SeP参与直肠癌的发生发展过程。Epplein等[19]研究报道，SeP是人体硒营养的生物标志物，而血液中硒水平低的成年人肺癌风险增加。本研究结果显示，HCC患者血清中SeP水平低于对照组，差异有统计学意义，且与患者肿瘤直径有关，说明SeP可能参与HCC的进展过程。刘侃等[20]研究报道，在人肾透明细胞癌细胞中过表达SeP亚型1基因，可引起细胞G2/M期阻滞，显著降低细胞增殖能力。

目前，甲胎蛋白(AFP)是筛查及诊断肝癌的主要血清标志物，但由于AFP在转录水平上受多种因素调控，其漏诊率较高，且特异性较差[21]。近年来，肝癌新标志物的探索研究发现，DKK1蛋白、GPC3、GP73等在肝癌诊断中表现出较好敏感性，但其诊断特异性和准确性具有一定局现性[22]。研究表明，肝癌患者血清中SeP和miR-7水平与血清AFP水平呈显著负相关关系，提示SeP和miR-7可能是肝癌临床诊断的潜在生物学标志物，此外，体外供给HCC癌细胞硒可明显改变细胞中miR-7表达[23]。本研究相关性分析显示，HCC患者血清中miR-7和SeP呈显著正相关关系，推测补硒可能通过上调miR-7和SeP对HCC治疗起积极作用。采用ROC曲线分析血清miR-7和SeP对HCC患者的诊断价值，结果显示血清miR-7和SeP单独检测诊断HCC的敏感度分别为75.44%、80.70%，特异度分别为84.00%、92.00%，而联合检测诊断HCC的敏感度和特异度分别为89.47%、96.00%，均高于其单独检测，说明血清miR-7和SeP对HCC有较好诊断价值，联合检测准确度更高。

综上所述，HCC患者血清中miR-7和SeP水平均降低，可能参与HCC发生发展过程，对HCC有较高的诊断价值。但本研究纳入病例数较少，结果可能具有一定偏倚性，下一步将继续在扩大样本基础上探讨miR-7和SeP在HCC治疗及预后中的作用。