乳腺癌组织中miR-214和FOXM1的表达变化及意义

李艳丽，胡晓丽，韩华，王义舫，付红霞

(1中国人民解放军第二六〇医院,石家庄050041；2河北省人民医院)

乳腺癌为女性常见的恶性肿瘤之一，是发达国家女性癌症相关死亡的主要原因[1]。虽然近年来乳腺癌的预后有所改善，患者5年生存率超过80%，但在手术治疗和全身辅助治疗后仍有约30%的患者发生远处转移[2]。微小RNA-214(miR-214)是微小核糖核酸(miRNA)家族成员之一，该基因位于人类染色体1q24.3区域DNM3 的14 号内含子上。miR-214已被证实在多种恶性肿瘤中表达增高或降低，作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤的发生进展[3]。但目前有关miR-214在乳腺癌中表达的研究甚少，且结果不一[4，5]。叉头盒蛋白质M1(FOXM1)属于Forkhead转录因子超家族的成员之一，研究已证实其在多数恶性肿瘤中表达增高，作为促癌基因参与肿瘤进程。近期在对miR-214靶基因的研究中发现，miR-214可通过调控FOXM1进而调控肿瘤细胞的生物学行为[6]。2018年1～3月，我们检测了miR-214、FOXM1 mRNA和蛋白在乳腺癌组织中的表达，分析其相关性及与乳腺癌患者临床病理特征的关系，为进一步研究miR-214和FOXM1在乳腺癌治疗中的作用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2015年1月～2017年1月中国人民解放军第二六〇医院手术切除的110例乳腺组织新鲜标本，同时收集相应的癌旁组织新鲜标本(距离原发病灶边缘至少5 cm)作为对照，组织标本在离体后生理盐水清洗，迅速置入液氮中，转入-80 ℃冰箱中保存备用。纳入标准：①女性患者；②经术后病理检查明确为原发性乳腺癌；③有完整的临床资料。排除标准：①术前接受过放化疗、生物免疫治疗等任何抗肿瘤治疗；②合并有其他器官的恶性肿瘤。110例乳腺癌患者中，≥55岁 72例，<55岁38例；绝经82例，未绝经28例；肿瘤最大直径≤2 cm 29例，>2 cm 81例；组织学分级Ⅰ级25例，Ⅱ+Ⅲ级85例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期80例，Ⅲ+Ⅳ期30例；有淋巴结转移72例，无淋巴结转移48例。本研究经医院伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 乳腺癌及癌旁组织中miR-214、FOXM1 mRNA表达检测 采用qRT-PCR法。按照miRNA提取试剂盒或RNA提取试剂盒(北京天根生化公司)说明书提取组织中miRNA或总RNA，分光光度计检测提取的miRNA或总RNA的纯度和浓度。按照逆转录试剂盒说明书操作，采用miR-214或FOXM1特异性逆转录引物合成cDNA。以cDNA为模板，按照qRT-PCR试剂盒说明书配置反应体系进行PCR反应，PCR反应条件：95 ℃ 15 min；40 个循环(95 ℃ 10 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 32 s)。miR-214正向引物：5′-GCACAGCAGGCACAGAC-3′，反向引物：5′-GCACAGCAGGCACAGAC-3′。U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。FOXM1正向引物：5′-AAGGTTGAGGAGCCTTCGAG-3′，反向引物：5′-ATTCGGTCGTTTCTGCTGCTT-3′。GAPDH正向引物：5′-CGGATTTGGTCGTATTGG-3′，反向引物：5′-TCCTG GAAGATGGTGATG-3′。miR-214以U6作为内参基因，FOXM1以GAPDH作为内参基因，相对表达采用2-△△Ct法计算。

1.3 乳腺癌及癌旁组织中FOXM1蛋白表达检测 采用Western blotting法。提取组织中总蛋白，BCA法定量蛋白质浓度。取30 μg/孔 样品上样，10% SDS-PAGE电泳分离(60 V 30 min，120 V 50 min)，湿转法转至PVDF膜(250 mA 90 min)，TBST洗膜3次，室温下5 %脱脂奶粉封闭2 h后，分别加入一抗人FOXM1(体积稀释比例1∶1 000)、GAPDH(体积稀释比例1∶8 000)抗体，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(体积稀释比例1∶2 000)，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL显影液显影，采集图片，Quantity One软件分析条带灰度。

2 结果

2.1 miR-214 mRNA在乳腺癌及癌旁组织中的表达比较 乳腺癌组织和癌旁组织中miR-214 mRNA的相对表达量分别为0.40±0.11、1.02±0.06。乳腺癌组织miR-214 mRNA的表达低于癌旁组织(P<0.05)。

2.2 FOXM1 mRNA和蛋白在乳腺癌和癌旁组织中的表达比较 乳腺癌和癌旁组织中FOXM1 mRNA的相对表达量分别为4.01±0.45、1.01±0.04，乳腺癌组织中FOXM1 mRNA表达高于癌旁组织(P<0.05)。乳腺癌和癌旁组织中FOXM1蛋白相对表达量分别为0.92±0.23、0.24±0.11，乳腺癌组织中FOXM1蛋白表达高于癌旁组织(P<0.05)。

2.3 乳腺癌组织中miR-214与FOXM1 mRNA的关系 Pearson相关分析显示，乳腺癌组织中miR-214和FOXM1 mRNA的表达呈负相关(r=-0.729，P<0.05)。

2.4 miR-214表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系 乳腺癌组织中miR-214表达与患者TNM分期及淋巴结转移有关(P均<0.05),而与年龄、绝经、肿瘤最大直径、组织学分级及ER、PR、HER-2无关(P均>0.05)。见表1。

表1 miR-214表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系±s)

2.5 FOXM1 mRNA和蛋白表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系 乳腺癌组织中FOXM1 mRNA和蛋白表达与患者肿瘤组织学分级、TNM分期及淋巴结转移均有关(P均<0.05),而与年龄、绝经、肿瘤最大直径及ER、PR、HER-2均无关(P均>0.05)。见表2。

3 讨论

乳腺癌的发生发展是一个多因素、多步骤、多基因参与的复杂生物学过程，多种癌基因的异常表达，多种抑癌基因的失活，DNA错配修复功能的缺失，导致细胞无限增殖，在恶性肿瘤的发生发展中起重要作用。miRNA是一类内源性单链小分子非编码RNA，研究发现miRNA作为癌基因或抑癌基因在多种恶性肿瘤中表达异常，影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移等生物学行为，已成为目前肿瘤研究及基因治疗的热点问题。miR-214是近期发现的miRNA家族重要成员之一，目前研究显示miR-214在诸多恶性肿瘤中表达异常，扮演癌基因或抑癌基因的角色，参与恶性肿瘤的发生发展。Wang等[7]在研究中发现miR-214在胶质瘤中表达降低，且与胶质瘤的病理分级呈负相关，起抑癌基因的作用。Penna等[8]在研究中报道miR-214 在转移性黑色素瘤细胞系及黑色素瘤组织中表达异常增高，可能起癌基因作用。Derfoul等[9]发现miR-214在人非转移性乳腺癌细胞系MCF-7及转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中表达明显降低，且转移性细胞系比非转移性细胞系中miR-214 水平更低。本研究发现，miR-214在乳腺癌组织中表达较相应癌旁组织低，差异有统计学意义，提示miR-214在乳腺癌发生发展过程中可能起抑癌基因作用。进一步分析发现乳腺癌组织中miR-214表达与患者TNM分期及淋巴结转移密切相关,Ⅲ～Ⅳ期组织中miR-214水平低于Ⅰ～Ⅱ期，差异有统计学意义；有淋巴结转移组织中miR-214水平低于无淋巴结转移组织中，差异有统计学意义，提示miR-214异常表达减低与乳腺癌发生发展及转移密切相关。

表2 FOXM1 mRNA和蛋白表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系±s)

FOXM1是Forkhead蛋白家族中的重要成员，基因定位于12p13.3，含有110个氨基酸，在调控细胞周期、纺锤体装配、染色体分离等方面发挥重要作用。研究发现FOXM1在胃癌[10]、胰腺癌[11]、食管鳞癌[12]等多种实体肿瘤中表达异常增高，且与患者的不良预后有关。FOXM1能促进肿瘤细胞增殖，抑制其凋亡，参与PI3K/AKT、Raf/ MEK/MAPK、Akt/Snail等多个重要信号途径，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[13]。本研究中我们发现，FOXM1 mRNA和蛋白在乳腺癌组织中表达均较相应癌旁组织升高，差异有统计学意义，提示FOXM1在乳腺癌发生发展过程中起癌基因作用。进一步分析发现乳腺癌组织中FOXM1 mRNA表达与肿瘤组织学分级、TNM分期及淋巴结转移密切相关,Ⅲ～Ⅳ期组织中FOXM1 mRNA水平高于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴结转移组织中FOXM1 mRNA水平高于无淋巴结转移组织中，Ⅱ～Ⅲ级组织中FOXM1 mRNA水平高于Ⅰ级，差异均有统计学意义，提示FOXM1异常表达增高与乳腺癌发生发展及转移密切相关。

某个特定的miRNA可调控多个靶基因，而某个特定的靶基因可受多个miRNA调控。目前已证实有诸多miRNA与靶基因共同作用参与乳腺癌的发生发展过程[14]。近期Wang等[6]研究发现，miR-214能通过靶向调控FOXM1基因表达，影响宫颈癌细胞的迁移、侵袭和对化疗药物的敏感性，提示miR-214能调控FOXM1表达共同参与恶性肿瘤的发生发展。本研究相关性分析结果显示，乳腺癌组织中miR-214和FOXM1 mRNA表达呈负相关关系，提示miR-214与FOXM1可能在乳腺癌中亦存在靶向调控关系，共同作用参与乳腺癌的发生发展。

综述所述，乳腺癌组织中miR-214表达异常降低，FOXM1表达异常增高;二者共同作用参与乳腺癌的发生发展。