抗SUMO抗体在原发性胆汁性胆管炎临床诊疗中的价值*

祁 双，舒李鑫，韩崇旭

(1.扬州大学医学院 江苏扬州 225009；2.南京东南大学生命科学研究院,江苏南京210096；3.扬州大学临床医学院/江苏省苏北人民医院，江苏扬州 225001)

原发性胆汁性胆管炎(PBC)是一种最终导致肝硬化和肝衰竭的典型慢性进展性自身免疫性疾病。病变特点是累及病人肝内胆管系统，表现为由自身免疫性T细胞引起的非化脓性胆管炎和门静脉浸润，并伴随小叶间的胆管损伤[1]。经美国肝病研究协会认可，满足以下3大标准任意2条即可确诊为PBC：(1)表明胆汁淤积的生化指标——碱性磷酸酶(ALP)水平的升高；(2)抗线粒体抗体(AMA)阳性；(3)肝组织活检显示非化脓性破坏性胆管炎及小叶间胆管破坏。约90%～95% PBC患者可检测出AMA的血清自身抗体，与AMAs相比，大约50%PBC患者具有血清抗核抗体(ANA)的存在[2]。ANA在PBC中的致病作用尚不清楚，但了解这些特异性自身抗体的发展过程似乎对解析PBC的致病机制至关重要。近来，表达类泛素化修饰物(SUMO)在疾病中的表达研究已初见成效，但其在PBC等自身免疫性疾病中的作用才刚刚研究。因此，基于先前的研究结果，笔者旨在探讨PBC和其他自身免疫性疾病中抗SUMO抗体的表达是否存在差异，抗SUMO抗体是否是潜在性的PBC特异性抗体。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究将于江苏省各大医院采集的412例PBC和596例其他自身免疫性疾病[包括296例系统性红斑狼疮(SLE)，103例干燥综合征(SS)，117例类风湿性关节炎(RA)及80例结缔组织病(CTD)]血清样本纳入研究。纳入的PBC患者均符合以下几条标准：(1)中国汉族人群；(2)肝脏的生化检测指标碱性磷酸酶(ALP)水平的异常升高；(3)生化指标显示胆汁淤积；(4)抗线粒体抗体/抗线粒体抗体亚型2(AMA-M2)血清学检测为阳性或ANA血清学检测为阳性；(5)无血吸虫感染史；(6)各类肝炎病毒感染以及人类免疫缺陷病毒抗体阴性(乙肝病毒表面抗原阴性、血清中乙肝病毒DNA小于200拷贝数/mL、血清中丙肝病毒RNA小于500拷贝数/mL、戊肝抗原阴性、人类免疫缺陷病毒抗体阴性)；(7)患者主诉饮酒量小于100 mL/d。纳入的其他自身免疫性疾病患者满足的条件如下：(1)中国汉族人群；(2)各类肝炎病毒感染以及人类免疫缺陷病毒抗体阴性；(3)ANA血清学检测为阳性；(4)通过病理结果等手段明确疾病的诊断，确诊为其他自身免疫性疾病中的一种。本课题选用的健康对照人数500例，对照来源于东南大学校医院健康体检的汉族人群(健康对照的纳入标准为临床基本检查处于正常范围内，包括临检常规检查和生化常规检查)。其中PBC样本包括男60例，女352例，平均年龄(55.1±11.3)岁。非PBC自身免疫性疾病样本包括男51例，女545例，平均年龄(45.1±14.9)岁。

1.2仪器与试剂

1.2.1仪器 电泳仪(上海天能科技有限公司)；PCR仪(美国 Bio-Rad公司)；紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；超声波细胞破碎仪XO-650D(南京先欧仪器制造有限公司)；狭缝式杂交点样器(乐购化工仪器BJKP-KP-31A)；冷冻离心机(德国Eppendorf 5810R)。

1.2.2试剂 DNA 6×Loading Buffer(日本TAKARA公司)；明胶(美国SIGMA公司)；脱脂奶粉(德国BIOFROXX公司)；Western Blot化学发光HRP底物ECL发光液(美国Millipore公司)；孔径0.22μm的PVDF膜(美国Millipore公司)；HRP标记山羊抗人IgG二抗(南京金斯瑞生物科技有限公司)；96孔酶标板(美国Thermo公司)；Tween-20(美国BIOSHARP公司)。

1.3方法

1.3.1菌种和质粒 pET-28a质粒购自南京金斯瑞生物科技有限公司；GB05-Dir大肠杆菌、BL21-DE3等由本实验室保存。

1.3.2引物的设计与合成 利用NCBI找到SUMO1、SUMO2、SUMO3 3种蛋白的编码序列，分别设计3对引物对3种目的片段进行PCR扩增。其中SUMO1蛋白上游引物FP：AGA AGG AGA TAT ACC ATG GGC ATG TCT GAC CAG GAG GCA，下游引物RP：GTG GTG GTG GTG GTG CTC GAG AAC TGT TGA ATG ACC CCC；SUMO2蛋白上游引物FP：AGA AGG AGA TAT ACC ATG GGC ATG GCC GAC GAA AAG CCC，下游引物RP：GTG GTG GTG GTG GTG CTC GAG GTA GAC ACA TCA CGT CTG；SUMO3蛋白上游引物FP：TTA AGA AGG AGA TAT ACC ATG TCC GAG GAG AAG CCC AAA GAG，下游引物RP：GTG GTG GTG GTG GTG CTC GAG GAA ACT GTG CCC TGC CAA GCT。

1.3.3人SUMO1、SUMO2、SUMO3基因原核表达载体的构建 利用聚合酶链式反应(PCR)扩增3种目的蛋白的DNA片段。PCR反应体系为：95 ℃，预变性3 min，95 ℃变性30 s、60 ℃复性30 s、72 ℃延伸35 s、30个循环后72 ℃ 5min终止反应。选择已构建好的含His标签序列的pET-28a质粒，根据多克隆位点以NcoI和XhoI作为酶切位点，对该质粒进行双酶切。将扩增的PCR产物和酶切后的质粒混合，导入GB05-Dir大肠杆菌培养。通过卡纳抗性筛选阳性单克隆，经PCR进行菌落扩增。采用成品试剂盒对过夜培养的菌种提取含目的DNA片段的重组质粒，采用紫外分光光度计测试其浓度。将提取的重组质粒送南京金斯瑞公司测序，以检测重组质粒是否构建成功。

1.3.4人SUMO1、SUMO2、SUMO3蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 将测序正确的人SUMO1、SUMO2、SUMO3重组质粒转化至BL21-DE3，选取阳性单克隆于液体培养基37 ℃振荡培养至OD值约为0.6。在诱导剂IPTG(1M/L)的条件下分别于37 ℃摇床培养4 h和25 ℃摇床过夜。收获不同条件下的菌液，SDS-PAGE电泳检测。最终确定菌种的最适诱导表达条件为37 ℃摇床培养4 h。

1.3.5人SUMO1、SUMO2、SUMO3蛋白表达产物分离与纯化 将置于-80 ℃冰箱保存的菌体取出，用20 mL 5mM咪唑(作为裂解缓冲液)(Lysis buffer)重悬。期间按1∶500添加PMSF以防止蛋白降解。再按1∶100添加溶菌酶(1 M/L)，之后每隔5 min涡旋振荡1次，冰上孵育30 min。超声破菌，功率36%，每次工作2 s，间歇3 s，待上清液澄清可透光提示破菌完成。采用亲和层析柱和超滤管进行蛋白的纯化。为防止蛋白降解，在超滤之后需将目的蛋白分装到若干个EP管中，做冷干，制成蛋白干粉并置于-80 ℃超低温冰箱长久保存。

1.3.6筛选PBC中抗SUMO抗体阳性样品 采用斑点印迹法初步大量筛查PBC患者血清样本中抗SUMO抗体阳性标本，实验保证每孔的蛋白上样量500 ng左右。通过Western blot验证斑点印迹法筛选出的抗SUMO抗体阳性样品，获取阳性参考血清。SDS-PAGE分离凝胶浓度为15%，样品量约为2.5 μg；SDS电泳条件：先低压再高压(从80 V，40 min至140 V，1 h);转膜条件：恒定电流，200 mA，1 h。

1.3.7建立抗SUMO抗体ELISA诊断体系 采用碳酸盐缓冲液作为SUMO蛋白(抗原)的包被液，分别设置100、200、300、500 ng 4个梯度进行实验以选取最适抗原包被量。加样后，用保鲜膜覆盖整块微孔板，4 ℃冰箱过夜。次日，弃去包被液，用PBST洗3遍，拍干。使用1%的明胶作为封闭液(1×PBS作为稀释液)封闭酶标反应孔，每孔加300 μL封闭液，室温下封闭2 h。2 h后弃去封闭液，用PBST洗3遍。加入稀释好的待检样品(PBC患者血清，稀释比为1∶200，稀释液为1%的BSA 磷酸盐缓冲液)，每孔加样100 μL，室温下孵育2 h。实验设置1∶200、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000 6个稀释梯度以确认最适一抗滴度。据说明书推荐的HRP标记的山羊抗人IgG二抗最适稀释比(1∶40 000，稀释液为1%的BSA 磷酸盐缓冲液)进行实验。最终A液和B液1∶1等比例(各50 uL)混合显色，2M H2SO4终止反应。

1.3.8Western blot和斑点印迹法验证ELISA筛选出的抗SUMO抗体阳性样品 将ELISA筛选出的抗SUMO抗体阳性标本通过Western blot和斑点印迹法验证，证明cutoff值的正确性和ELISA体系的有效性。实验步骤同上述1.3.6。

2 结 果

2.1SUMO 3种蛋白亚型的纯化结果 通过NCBI找到SUMO1、SUMO2、SUMO3 3种蛋白亚型的编码序列，构建3种重组质粒。待质粒构建成功后，将其分别导入大肠杆菌进行蛋白的诱导与表达。通过条件的不断改进，获得条带单一、纯度较高的目的蛋白。3种蛋白亚型纯化结果如图1所示。

注：图中M代表蛋白Marker，目的蛋白在(17～18)×103左右

图1 3种SUMO蛋白亚型的纯化结果

2.2抗SUMO抗体ELISA诊断体系的构建

2.2.1获取抗SUMO抗体阳性样本 412例PBC患者样本进行抗SUMO抗体阳性的初步筛查。部分结果如图2示。为证明斑点印迹检验系统的有效性，笔者从初筛出的抗SUMO阳性样品中随机挑选出部分，采用Western blot方法再次验证。结果显示2种检验方法的结果基本上是一致的。

2.2.2确定最适ELISA抗原包被量和一抗滴度 经实验条件的不断改进，以阳参和阴参样品的OD值能拉开较大差距的抗原包被量和一抗滴度为最佳浓度，确定本实验选取的最佳抗原包被量为500 ng，1∶200为最佳血清稀释比。

2.3ELISA诊断效率的评价 在构建抗SUMO抗体检测的最佳ELISA诊断体系后需要对该体系的诊断效率进行评价。用已验证的抗SUMO抗体阳性的PBC标本作为阳性样本，健康人的体检样本作为阴性样本进行ELISA诊断性能的评价，分别统计实验的阴阳性例数，计算灵敏度和特异度[特异度=真阴性/(真阴性+假阳性)×100%；灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)×100%]。如表1所示。

注：图中BP(BCOADC-PDC耦联的抗原)为PBC患者的检验标志物，作为阳参；cTnT、cTnI、IL21为阴参；图左边编号为PBC患者的样本编号；图A和图B是PBC样品的斑点印迹图，图C是PBC样品的Western blot图

图2 PBC样本的部分斑点印迹图和Western blot图表1 抗SUMO抗体 ELISA诊断效率评价(%)

注：cut off值=3×mean control OD，OD值大于1.1×cutoff值的样品定义为阳性，OD值介于0.9×cut off值和1.1×cut off值之间的样品定义为灰区，灰区样品二次验证，若仍处于灰区，则定义为阳性

注：图中AID代表自身免疫性疾病，A显示抗SUMO抗体在PBC和健康对照中的表达；B显示非PBC自身免疫性疾病和健康对照中抗SUMO抗体的表达分布

图3抗SUMO抗体在PBC，其他自身免疫性疾病及健康对照中的表达

2.4ELISA检验PBC和其他自身免疫性疾病血清样本 用构建的ELISA诊断体系对412例PBC血清样本和596例其他自身免疫性疾病(包括CTD 80例，SLE 296例，RA 117例，SS 103例)血清样本进行ELISA检验。结果如图3所示。

2.5Western blot和斑点印迹法验证其他自身免疫性疾病中抗SUMO抗体阳性标本 随机挑选通过ELISA筛选出的其他自身免疫性疾病中的抗SUMO抗体阳性标本进行Western blot和斑点印迹法的验证，以证明ELISA检测系统的有效性。见图4。

注:图中BP(BCOADC-PDC耦联的抗原)为PBC患者的检验标志物；cTnT、cTnI、IL21为阴参。样品SLE152经查病历证实患有心肌梗死性疾病

图4其他自身免疫性疾病样品的部分Western blot和斑点印迹图

2.6PBC和其他自身免疫性疾病中抗SUMO抗体阳性率比较 对412例PBC样本和596例其他自身免疫性疾病样本进行ELISA检测，统计抗SUMO抗体两组样本中的阳性率。采用统计学方法χ2检验计算二者的阳性率差异。实验结果如表2所示。结果显示3种抗SUMO抗体在PBC和其他自身免疫性疾病人群中的阳性率存在显著差异，差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 抗SUMO抗体在PBC及其他自身免疫性疾病中的阳性率比较[n(%)]

注：其他自免疾病包括CTD 80例，SLE 296例，RA 117例及SS 103例

2.7其他自身免疫性疾病中的抗SUMO抗体阳性率表达 实验对596例其他自身免疫性疾病(CTD 80例，SLE 296例，RA 117例及SS 103例)进行ELISA检测，统计抗SUMO抗体的阳性率(图5)。采用χ2检验分析比较4组间的阳性率差异，结果如表3所示。结果显示，抗SUMO抗体在其他自身免疫性疾病中的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)，因此认为抗SUMO抗体对于鉴定其他自身免疫性疾病无意义。

表3 抗SUMO抗体在其他自身免疫性疾病中的阳性率比较[n(%)]

图5 其他自身免疫性疾病中抗SUMO抗体的阳性率表达分布

3 讨 论

PBC的治疗效果不佳，早期诊断和治疗是控制PBC疾病发展的最有效手段。但不同的PBC患者，他们的病症表现不尽相同，同时也伴随不同的并发症，这对患者的对症治疗产生很大的难度。

目前，针对PBC的特异性抗体包括AMA-M2、抗核抗体Sp100及抗Gp210。AMA因其特异度高，是PBC的关键性诊断标志。PBC的血清学特征是高滴度的AMA，其主要靶点为BCOADC-E2、PDC-E2和OGDC-E2。但是，AMA也可在其他疾病如硬皮病中检测到。因此，寻找新的血清标志物，如抗SUMO抗体，对于区分PBC与其他自身免疫性疾病至关重要[3-4]。

SUMO蛋白分布广泛。人类基因组主要编码4种SUMO蛋白亚型SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4[5]。其中，SUMO1～3起主要作用并在各种组织中均有表达，而SUMO4主要在肾、脾和淋巴结中表达[6]。在各亚型中，SUMO1和SUMO2具有50%的序列同源性，SUMO2和SUMO3高度相似，仅有3个氨基酸差异，同源性高达95%，所以经常共写为SUMO2/3[7-8]。在针对3种SUMO蛋白亚型的实验组中，笔者发现抗SUMO2抗体和抗SUMO3抗体在PBC和其他自身免疫性疾病两组间的阳性率差异P值接近(表2)，表明SUMO2和SUMO3二者同源性高。鉴于成熟SUMO2和SUMO3蛋白之间的高度同源性，笔者推测识别抗SUMO2抗体的疾病也可能同时识别抗SUMO3抗体，这有待后续实验进一步考证。

PBC起病隐匿，表现为慢性进行性胆汁淤积性肝病，最终导致肝硬化和肝功能衰竭。其作为典型的自身免疫性疾病的一种，目前诊断依赖于临床表现，特异性自身抗体的检测和病理组织学检查[9-11]。AMA-M2是PBC的特异性抗体，其特异度高达95%，但AMA对PBC的诊断仍有局限性，约有10%的PBC患者AMA阴性，这给诊断带来一定困难，有时需依赖有创检查肝活检，存在一定风险且患者依从性差[12-13]。本研究发现抗SUMO抗体在PBC中的诊断特异度高达99%，其灵敏度保持在86%左右(表1)。表明抗SUMO抗体可以成为辅助诊断PBC的一个新的血清标志物。

PBC常伴有其他自身免疫性疾病，包括SS、SLE、CTD、RA等。本研究发现上述其他自身免疫性疾病中3种抗SUMO抗体均有一定的检出率，尤以SS和RA较高，提示这类患者有合并潜在的亚临床PBC的可能性，需要密切随访，以便于早期发现，早期治疗，改善疾病预后[14]。笔者还发现抗SUMO抗体在PBC中的阳性率明显高于其他自身免疫性疾病组和健康对照组，阳性表达率差异有统计学意义(表2)，说明抗SUMO抗体和PBC存在很好的相关性，对于辅助诊断PBC具有良好的效益。鉴于非PBC的自身免疫性疾病中的抗SUMO抗体的低阳性率(图5)，笔者对296例SLE，103例SS，80例CTD及117例RA进行研究，发现抗SUMO抗体在其他自身免疫性疾病人群中的阳性率无明显差异(表3)，说明抗SUMO抗体对于鉴定其他非PBC的自身免疫性疾病无特异度，抗SUMO抗体有望成为诊断PBC的潜在性特异性抗体。

像其他PBC自身抗体一样，抗SUMO抗体在PBC或其他自身免疫性疾病中的发病机制仍然未知。有趣的是，一项研究表明大量的SUMO结合物可以在线粒体中找到，尽管构成AMA自身抗原的线粒体复合物的SUMO化尚未报道。线粒体抗原的异常表达归因于在应激条件下失调的自噬，最终导致自身免疫介导的细胞毒性反应，特别是小胆管的损伤。因此后期研究抗SUMO抗体产生是否是细胞因子依赖性将是有意义的。另外据文献报道，抗Sp100抗体表达可能通过介导胆管细胞增生参与PBC发病[15]。胆管细胞增生在PBC组织病理中较常见，胆管性界面炎含有增生胆管和肉芽肿的碎屑样坏死，提示胆管细胞增生在PBC的进展中起到一定作用。而SUMO蛋白可以通过修饰Sp100蛋白发挥SUMO化修饰作用，表明SUMO对于PBC的致病机制也有可能一部分是通过介导胆管细胞增生实现的。

PBC是复杂性自身免疫性疾病研究的极佳模型，与其他自身免疫性疾病相比，PBC具有明显的组织专一性和很强的遗传易感性。目前，熊去氧胆酸是对早期PBC患者(尤其是黄疸没有出现的患者)进行有效控制的药物，但无治愈作用。而挽救晚期PBC患者的唯一手段是实施肝脏移植手术治疗[16-17]。鉴于SUMO在PBC中可以作为一种新的抗原成分，而SUMO化修饰和去SUMO化修饰过程的失控可能使细胞不能维持动态平衡，进而暗示着疾病的发展。所以，对SUMO化的研究可能蕴含着治疗PBC疾病的潜在靶点。

诊断试验的持续改进导致对轻度或明显无症状疾病的个体的检测陷入热潮。另外，特别是基于患者基因型和表型的分层将在未来变得重要。本研究结果表明，抗SUMO抗体是高特异度的PBC新标记物，有必要将抗SUMO抗体纳入PBC的血清学评估。这将有助于消除PBC诊断不确定性，提高诊断效率，建立PBC早期诊断方法和诊断指标，并评估PBC预后药物的个体化以提供标准化的临床诊断和治疗方案。

4 结 论

本研究通过建立抗SUMO抗体的ELISA诊断体系，分别检测抗SUMO抗体在PBC、SLE、SS、CTD、RA 5种典型性自身免疫性疾病血清样本中的阳性率表达，最终证实抗SUMO抗体和PBC存在很好相关性，有望成为诊断PBC的特异度抗体。其创新之处在于分别构建了SUMO1、SUMO2、SUMO3 3种蛋白亚型的表达质粒并分别研究3种抗SUMO抗体在5种自身免疫性疾病中的表达，其有利于后期提高疾病的诊断效率，并具有广泛的临床应用和推广前景。但本实验并未证明抗SUMO抗体与PBC间的直接因果性，因此未来研究方向将进一步揭示抗SUMO抗体的状态是否与PBC的临床进程相关并分析PBC患者接受熊去氧胆酸前后抗SUMO抗体的变化等。