腺苷脱氨酶三种原核表达载体的构建及蛋白表达*

韩丽乔，张 露，林海标，黄小亭，吴新忠，黄宪章，庄俊华

(广州中医药大学第二附属医院，广东广州 510120)

腺苷脱氨酶(ADA)是机体一种重要的核酸代谢关键酶，在体内催化腺嘌呤核苷(脱氧腺嘌呤核苷)不可逆的脱氨，最终生成尿酸的反应[1]。ADA还可参与机体的免疫应答，诱导T细胞依赖的单核细胞分化为巨噬细胞并刺激其增殖，缺乏将导致重症联合免疫缺陷等[2-3]。ADA在临床多种疾病的诊断和鉴别诊断中具有重要应用价值，如结核性、化脓性、病毒性胸腹水、脑脊液的鉴别诊断等[4-8]。因此，腺苷脱氨酶的准确定量在临床检验中较为重要。目前关于酶的定量都是基于酶在单位时间内催化1 μmol底物的转化速率来评估其活性，但影响其测量因素较多，如检测温度、底物浓度、反应体系pH等，而且目前国内尚无ADA的参考物质，国外BOTA等[9]报道的参考物质从红细胞中提取获得，需要耗费大量的原材料，且过程复杂，价格昂贵，因此本课题组利用成熟的分子生物学技术，同时构建了3种ADA原核载体(pET-28b+ADA，pET-32a+ADA，pHSIE+ADA)分别在大肠杆菌BL21(DE3)中进行腺苷脱氨酶蛋白的诱导表达，选择最优，进而用于ADA参考物质的研究。

1 材料与方法

1.1材料 逆转录试剂盒(Fermentas 公司)，质粒小提试剂盒(北京康为世纪公司)，DNA回收试剂盒(OMEGA公司)，KOD-Plus高保真聚合酶试剂盒(TOYOBO公司)，限制性内切酶Ecor 1、Nco1、Xho1、Hind Ⅲ及T4 DNA连接酶(Takara 公司)，氨苄霉素、卡那霉素(北京鼎国)，IPTG、CaCl2、Tris、Na2HPO4、KH2PO4、KCl、NaCl、EDTA、硼酸(sigma)，酵母提取物和胰蛋白胨(OXOID公司)，琼脂粉(上海生工)，琼脂糖(invitrogen公司)，以及Western-blot相关试剂及设备(Bio-Rad)。3种原核质粒分别是pET-28b,pHSIE和pET-32a，前两种由清华大学深圳研究生院生命科学院馈赠，pET-32a、大肠杆菌DH5α克隆菌株和BL21(DE3)表达菌株，为本实验室保存。

1.2方法

1.2.1目的基因序列获取与引物合成 从pubmed基因库查得人腺苷脱氨酶基因序列[Homo sapiens adenosine deaminase (ADA)，mRNA][10]。 根据目的基因和3种原核克隆载体(pET-28b，pET-32a，pHSIE)的序列及插入位点信息，每个载体合成一对引物，分别为：P1：5′-CCA TGG CCC AGA CGC CCG CCT TCG AC -3′(Nco1酶切位点) P2：5′- CTC GAG GAG GTT CTG CCC TGC AGA -3′ (Xho l酶切位点)； P1：5′- GAA TTC GCC CAG ACG CCC GCC TTC GAC -3′(Ecor 1酶切位点) P2：5′- AAG CTT TCA GAG GTT CTG CCC TGC AGA -3′ (Hind Ⅲ酶切位点) ；P1：5′- GAA TTC GCC CAG ACG CCC GCC TTC GAC -3′(Ecor 1酶切位点) P2：5′- AAG CTT TCA GAG GTT CTG CCC TGC AGA -3′ (Hind Ⅲ酶切位点)，加粗部分为内切酶序列，引物由Invitrogen公司合成。

1.2.2基因提取及目的基因扩增 用Trizol方法从健康成年人的白细胞中提取总mRNA，进一步逆转录合成cDNA。 再以cDNA为模板，分别大量扩增设有不同内切酶位点的目的基因，聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定扩增结果并分别切胶回收，纯化PCR产物并用紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度。

1.2.3目的基因和质粒的剪接 分别将目的基因和空载质粒于内切酶的酶切条件下水浴双酶切，经凝胶电泳鉴定后切胶回收。将酶切好的目的基因和3种质粒分别用T4连接酶于16 ℃过夜连接。

1.2.4构建重组克隆载体并进行阳性菌落鉴定 用CaCl2法制备DH5α感受态，将重组质粒加入含有DH5α感受态的溶液中，于冰上30 min，随后42 ℃水浴锅中准确热击90 s，立即于冰上2 min，再加入37 ℃预热的无抗菌药物的LB培养基，于37 ℃，220 r/min振荡培养约1 h，均匀涂于含抗菌药物的LB培养皿中，倒置于37 ℃，培养过夜。根据各自抗性，筛选阳性克隆菌，并进行菌落PCR鉴定。将PCR鉴定阳性单菌落接种于含相应抗菌药物的LB培养基，37 ℃，220 r/min振荡培养过夜，进行小量扩增。第二天提取质粒，将质粒溶液收集到离心管中，取少量进行酶切验证。

1.2.5构建重组表达载体 将酶切验证阳性的克隆质粒(pET-28b+ADA，pET-32a+ADA，pHSIE+ADA)分别转化入BL21(DE3)表达菌，抗菌药物初步筛选，挑取阳性菌落培养扩增后送测序鉴定。

1.2.6目的蛋白诱导表达及鉴定 将测序正确的阳性克隆菌株5 μL接种到含相应抗菌药物的LB培养基5 mL中，37 ℃，220 r/min振荡培养过夜。培养过夜的阳性克隆菌株1 mL接种到含相应抗菌药物的99 mL LB培养基中，培养2.0～2.5 h，至OD600=0.6～0.8，加入不同浓度IPTG(0.4、0.8、1.0 mmol/L)，分别于诱导0、3、6、12、24 h后取样，加入SDS 蛋白电泳上样缓冲液，煮沸10 min，使蛋白充分变性后于-80 ℃冻存待测。Western-blot 或SDS-PAGE对蛋白进行定性和半定量分析。

1.2.7目的蛋白活性初步鉴定 按照筛选的ADA蛋白表达条件，小量表达目的蛋白。将表达菌液、菌液超声破坏菌体后液体，在罗氏生化分析仪初步检测目的蛋白的活性。

2 结 果

2.1目的基因扩增结果 目的基因(约1 100 bp)扩增后分别经琼脂糖凝胶电泳检测，在1 000 bp上方有清晰条带，与预期相符，见图1A、B。

2.2阳性克隆菌落鉴定结果 挑选不同载体的阳性菌落，进行菌落PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示，在1 000 bp上方有明显清晰条带，与目的条带(1 100 bp)相符，见图2。

注：A中M为DNA Ladder DL2000， 1、2、3分别为pET-28b、pET-32a、pHSIE不同引物扩增的目的基因产物(1 100 bp)；B中M为DNA ladder DL5000，1、2为pET-32a空载质粒(5 900 bp)，3、4为pET-28b空载质粒(5 369 bp)，5为扩增的ADA序列(1 100 bp)

图1腺苷脱氨酶PCR扩增基因序列及空载质粒电泳图

注：M为DNA Ladder DL2000，1、2为DH5α+ pET-28b + ADA菌落扩增结果，3、4为DH5α+ pET-32a + ADA扩增结果，5、6为DH5α+ pHSIE + ADA菌落扩增结果

图2阳性菌落PCR扩增ADA基因序列

注：A表达菌落BL21提取的pET-28b+ADA 测序结果比对部分图；B表达菌落BL21提取的pET-32a + ADA测序结果部分图；C表达菌落BL21提取的pHSIE + ADA测序结果部分图

图3阳性表达菌落测序比对结果(部分)图

2.3阳性表达菌落测序结果 挑选BL21+ pET-28b + ADA， BL21+ pET-32a + ADA，BL21+ pHSIE + ADA阳性菌落小量培养后提取质粒，送Invitrogen公司测序。测序结果与NCBI网站基因信息比对，结果显示，3种融合质粒中ADA编码序列全部完整无突变(比对结果Identities 100%,Gaps 0%)，见图3。

2.43种载体蛋白的表达及条件优化 3个表达系统分别在不同的表达时间(3、6、12、24 h) ，表达温度(10、16、25、37 ℃)和诱导剂浓度(IPTG:0.4、0.8、1.0 mmol/L)下进行蛋白表达，通过Western-blot定性及PAGE半定量，选择各载体最优表达条件。结果见图4。

注：N为阴性对照

图4 3种原核表达载体在不同条件下的蛋白表达

结果显示，随诱导时间和诱导温度的增加，3种原核表达系统的蛋白表达量增多，考虑到时间成本和原核载体在较高温度下容易形成包涵体等问题，最终采取的表达温度为16 ℃，诱导蛋白表达24 h。诱导剂IPTG的浓度0.4、0.8、1.0 mmol/L诱导蛋白表达量相差不大，所以最终选择IPTG的诱导浓度为0.4 mmol/L。

2.5目的蛋白活性初步鉴定结果 经检测，菌液中ADA活性较低，菌液超声破碎后ADA活性较高，具体数据见表1。

表1 超声前后菌液的ADA活性(U/L)

3 讨 论

参考物质从1906年美国标准局(现为国家标准技术研究院，NIST)制备和颁布了第一批冶金参考物质以来经历了100多年的发展，在化学、生物、工程、物理等领域都发挥了巨大的作用，我国自1994年以来参照国际标准和相关导则也逐步制定了自己的标准和技术规范[11]，经过20多年的发展，我国已研制了千余种参考物质，虽然参考物质的研究取得了很大的成效，但其种类数量还远远不能满足各个领域的需要，参考物质研制的任务依然艰巨。目前国内尚无ADA的参考物质，国际ADA参考物质来源于红细胞[9]，从7 L压缩红细胞中经历洗涤、裂解、层析等复杂步骤最终获得了0.7 mg的ADA纯物质，原材料不易获得，操作过程繁杂，价格昂贵。分子克隆技术近年来已发展成熟稳定和可靠，在诸多领域都有出色的应用，如谷草转氨酶、谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶等多项酶学参考物质的原材料均来源于原核菌株克隆蛋白的表达[12-14]，因此本实验利用分子克隆技术构建了3种ADA的原核表达载体，并成功表达了ADA蛋白。

原核表达系统培养设备及操作简单，生长条件要求不高，营养物质价格低廉，具有增殖速度快，转化效率高，表达周期短和表达量高的优点，适于大规模批量蛋白生产，是目前应用最为广泛的蛋白表达系统[15]。本实验选用较为常用的大肠杆菌表达系统BL21(DE3)，这种表达体系是发展最早也是最成熟的外源蛋白表达系统，其具有遗传背景清楚，表达水平稳定，易操作，有许多菌株突变体和含强启动子的载体可供选择，并且成本低、蛋白表达量高、容易纯化等优点。在实验中笔者构建的3种原核表达体系：BL21+pET-28b+ADA，BL21+pET-32a+ADA，BL21+pHSIE+ADA，所用到的3种质粒载体各有特色，pET-28b质粒，经过插入位点设计，只带有1个很小的多聚组氨酸(His)标签，使得表达的蛋白分子大小与天然的蛋白分子量相差不大，且His标签便于后续的蛋白纯化；pET-32a质粒载体，除带有His标签外，还带有1个促进表达蛋白可溶的基团，可增加蛋白的可溶性，但是也会使表达蛋白的分子量增大；pHSIE质粒[16]除带有His标签，促表达蛋白可溶基团外，还带有1个断裂位点，该位点可通过蛋白纯化过程中调节洗脱液的pH来使得促表达蛋白的可溶基团断裂，可使得表达蛋白与天然蛋白保持一致性。

本实验笔者成功将ADA序列连接入相应的质粒载体，但在进行过程中也遇到了一些小问题：如(1)引物的设计，需根据扩增目的(检测引物，扩增引物等)按照引物设计原则和质粒载体序列设计合适的引物，加入合适的内切酶位点，同时要确认目的片段中无该酶切位点，这直接关系着酶切及连接等操作的成败；(2)目的基因的PCR扩增，应使用具有高保真性能和扩增范围内的高保真扩增酶，优化扩增条件，方能保证扩增所需序列的正确性；(3)感受态菌的制备，需熟练轻柔操作，并一定保证在低温冰浴条件进行，另外用于制备感受态的菌液浓度要合适，才能保证制备的感受态菌具有较高的转化效率；(4)对于蛋白诱导表达，诱导剂IPTG的浓度对于蛋白表达量影响不大，虽然随时间和温度增加，3种载体的蛋白表达量均升高，但原核蛋白在较低温度表达时速度减慢，有利于蛋白折叠，形成有活性的蛋白，所以最终确定的IPTG浓度为0.4 mmol/L，诱导温度均为16 ℃，诱导时间为24 h。

本实验构建的3种原核载体表达的ADA蛋白，经活性检测发现菌液超声后活性较高，说明3种原核载体均非分泌表达。后期实验将利用3个原核载体的特点，使用His-Ni柱或pH变化进行蛋白纯化，而如何获得高纯度高活性的ADA蛋白是后续研究的重点问题。

4 结 论

本实验成功构建了腺苷脱氨酶的3个原核表达体系(BL21+pET-28b+ADA，BL21+pET-32a+ADA，BL21+pHSIE+ADA)且3个体系均成功表达了有活性的ADA蛋白，表达量可观，可满足后续ADA标准物质研制的原材料需求，且操作简单，经济实用。