儿童GJB2基因p.V37I位点突变与耳聋临床表型的相关性研究

王现蕾 王雪瑶 赵雪雷 程晓华 黄丽辉

首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科 北京市耳鼻咽喉科研究所耳鼻咽喉头颈外科学教育部重点实验室（北京100005）

GJB2基因突变是引起遗传性非综合征型聋（nonsyndromic hearing loss，NSHL）的主要因素，其基因突变具有明显的种族差异性，亚洲地区以c.235delC突变最为常见[1]，近期研究发现，p.V37I(c.109G＞A)突变在亚洲的携带率也很高[2]，p.V37I突变最初被认为是单核苷酸基因多态性（Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs）[3]，之后研究发现其与迟发性听力损失密切相关[2]。本课题组前期曾发现20例GJB2基因p.V37I杂合突变儿童中，19例出现轻、中度感音神经性耳聋[4]，本研究对GJB2基因p.V37I位点突变儿童的临床听力学特点进行分析，比较不同基因型突变儿童听力学表型的差异，进一步探讨GJB2基因p.V37I基因突变的临床意义，为遗传咨询提供临床依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2012年至2018年间，于我院儿童听力诊断中心就诊，接受新生儿耳聋基因筛查及GJB2基因全编码区测序的儿童812例，检出c.235delC/p.V37I、c.299delAT/p.V37I及c.176del16/p.V37I复合杂合突变47例，共纳入资料完整者41例。其中男26例、女15例。纳入标准：1.接受新生儿耳聋基因筛查及GJB2基因全编码区检测，确诊为GJB2基因c.235delC/p.V37I、c.299delAT/p.V37I及c.176del16/p.V37I复合杂合突变者；2.接受新生儿听力筛查(universal newborn hearing screening,UNSH)并有明确结果者；3.已进行听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)、听性稳态反应（auditory steady-state response,ASSR)、畸变产物耳声发射(distortion production otoacoustic emission,DPOAE)、声导抗(acoustic immittance,AI)和小儿行为测听等听力学检测者；4.听力正常或感音神经性聋者。

1.2 测试方法

1.2.1 耳聋基因检测

首先进行血液基因组DNA提取，然后根据样本量计算需配制的PCR扩增体系，选自目的片段扩增程序进行扩增，纯化PCR扩增产物后，进行电泳实验。根据Big Dye v3.1测序试剂说明书配置测序体系，并按特定测序程序进行测序反应，然后按3730xl DNA分析仪标准上机操作进行毛细管电泳检测。最后将测序峰图文件导入SMD软件，使用软件识别测序结果（包括杂合位点），去除峰图两端的低质量序列，并将高质量序列与目的基因的参考序列进行比对分析，找出突变位点并进行注释。

1.2.2 听力测试

1.2.2.1 声导抗

应用美国GSI–Tympstar中耳分析仪。探采用226 Hz和1 k Hz、85 dB SPL探测音，外耳道压力从+200daPa向-400daPa方向变化，压力变化速率为50daPa/s。测试时选择合适的探头，使其与耳道口密闭良好。226Hz探测音鼓室图根据Li den-Jerger分型对鼓室图进行分类：A型（包括As和Ad两个亚型）、B型和C型。1kHz根据有无峰及峰的数目对图形进行分类：单峰型、双峰型、平坦型。

1.2.2.2 ABR测试

采用美国Nicolet公司生产的Spirit诱发电位仪，于符合国家标准的电屏蔽隔声室进行。根据小儿体重服用一定量6.5%水合氯醛溶液，于睡眠状态下测试。刺激声为交替极性的短声(click)，脉宽0.1ms，刺激声起始强度80dB nHL，刺激重复率19.9次/s，分析时间12 ms，带通滤波100-3000 Hz，叠加次数1000次。电极：前额为记录电极，声刺激侧乳突为参考电极，眉间为接地电极。

1.2.2.3 DPOAE测试

使用英国Otodynamics公司生产的IL092型耳声发射仪，测试条件：同时使用2个刺激纯音f1、f2，强度fl=f2=70 dB，f2:fl=1.22；刺激声岔的频率点为696、1001、1501、2002、3003、4004、5005 和 6006 Hz。DPOAE的正常标准：每个分析频率点畸变产物(distortion product，DP)的值在正常范围内，同时该频率点的幅值大于该点噪声6 dB。

1.2.2.4 ASSR测试

应用丹麦Eclipse ASSR诱发电位仪，于符合国家标准的电屏蔽隔声室进行。采用ASSR常规参数设置，刺激声频率为：0.5kHz、1kHz、2kHz及4kHz。根据小儿公斤体重服用一定量10%水合氯醛溶液，于睡眠状态下测试。

1.2.2.5 小儿行为测听

应用丹麦尔听美Conera纯音听力计，插入式耳机ER-3A。在符合国家标准即环境噪声＜20dB(A)的隔声室进行。根据婴幼儿年龄及发育状况选择行为观察测听(behavioral observation audiometry,BOA)、视觉强化测听(visual reinforcement audiometry,VRA)、游戏测听(play audiometry,PA)。测试中测试者和诱导观察者相互配合，使小儿建立良好的条件反射，获得小儿行为听阈。

1.3 分析方法

1.3.1 研究对象分组

本研究按照新生儿耳聋基因筛查及GJB2基因全编码区检测结果将研究对象分为3组，分别为c.235delC/p.V37I、c.299delAT/p.V37I及c.176del16/p.V37I复合杂合突变组，对3组儿童听力筛查通过率、听力损失程度及听力曲线分型进行统计，分析其差异。

1.3.2 听力损失程度分级

按照WHO(1997)制定标准[5]，以小儿行为测听气导0.5kHz,1kHz,2kHz,4 kHz平均听阈评估听力损失程度分级。听力损失分级标准：轻度：26-40dB HL，中度：41-60dB HL，重度：61-80dB HL，81dBHL以上为极重度听力损失。

本研究将无法配合小儿行为测听的患儿，运用ASSR听反应阈与行为测听预估听阈听敏度校正因子将正常听力级(nHL)换算为预估听力级(eHL)。预估听力级为依据电生理测试的听反应阈所预估的纯音听阈(HL)。若双耳听力损失程度不一致，以听力损失较轻耳别统计例数。

1.3.3 听力曲线分型

根据Mazzoli等[6]提出的对听力曲线描述，将其分为：高频下降型（包括缓降型和陡降型）、平坦型、上升型和U型。且当最大声输出无反应时，默认为听力图无法判别。

2 结果

2.1 一般情况

根据新生儿耳聋基因筛查及GJB2基因全编码区检测结果，共纳入GJB2基因包含c.235delC、c.299delAT、c.176del16和p.V37I复合杂合突变儿童41例，其中男26例、女15例，所有儿童均携带p.V37I杂合突变(表1)，年龄范围：3-78个月；平均年龄：27.6±19.1个月；中位年龄：28个月。首诊年龄范围：2-24个月，平均首诊年龄：5.3±4.0个月，中位首诊年龄：4个月。1例儿童有家族史，所有儿童均无出生及母孕期异常。

2.2 基因检测结果

通过新生儿耳聋基因筛查及GJB2基因全编码区检测，共检出3种基因型，以c.235delC/p.V37I复合杂合突变为主，共25例，占60.98%。其余两种基因型分别为c.299delAT/p.V37I，共13例，占31.71%；c.176del16/p.V37I，共 3例，占 7.31%，未检出c.35delG突变位点。

2.3 新生儿听力筛查及听力诊断结果

所有儿童均接受新生儿听力筛查及听力诊断。新生儿听力筛查通过13例（31.7%），未通过28例（68.3%）。经听力诊断，听力正常16例（39.0%），听力损失25例（61.0%），均为双侧感音神经性听力损失。25例听力损失患儿中，轻度14例（56.0%）、中度11例（44.0%），无重度、极重度听力损失。13例通过听力筛查的新生儿中，3例（23.0%）之后确诊为轻度听力损失,1例（7.7%）确诊为中度听力损失；25例未通过听力筛查的新生儿中，7例（28.0%）之后诊断为听力正常（表1）。

表1 儿童基本信息及听力结果Table 1 Demographic information and audiological diagnoses of subjects

2.4 基因型与临床听力学特点

2.4.1 基因型与听力筛查

c.235delC/p.V37I及c.299delAT/p.V37I突变者，新生儿听力筛查结果均以未通过为主，分别为18例（72.7%）、9例（66.7%）。c.176del16/p.V37I儿童新生儿听力筛查通过2例（66.7%），未通过1例（33.3%）（表2）。

2.4.2 基因型与听力诊断

c.235delC/p.V37I突变者，听力正常12例（48.0%，12/25），听力损失13例（52.0%，13/25），以轻度为主。c.299delAT/p.V37I突变者，听力正常3例（23.0%，3/13），听力损失为10例（77.0%，10/13），以中度为主，共6例（60.0%，6/10）。c.176del16/p.V37I突变者，听力正常1例，听力损失2例，其中轻度听力损失1例，中度听力损失1例（表3）。

25例听力损失者，50例患耳中听力损失曲线类型由多到少依次为：平坦型29耳(58.0%)，高频下降型12耳(24.0%)，U型 6耳(12.0%)，上升型3耳(6.0%)。 c.235delC/p.V37I、c.299delAT/p.V37I 及c.176del16/p.V37I三组均以平坦型为主，分别占61.5%、55.0%及50.0%（表4）。

表2 三种基因型听力筛查结果（例，%）Table 2 Results of hearing screening across three groups(case,%)

表3 三种基因型听力程度结果（例，%）Table 3 Result of degree of hearing loss across three groups（case,%）

表4 三种基因型听力曲线结果（耳，%）Table 4 Curve type of hearing loss across three groups（ear,%）

3 讨论

耳聋是最常见的先天性感觉障碍，其发病率在新生儿中约占1/500，在4岁以上的儿童中则上升至 1/300[7]。1997年，Kelsell等[8]首次提出GJB2基因与NSHL相关。此后研究证明，GJB2基因是NSHL最常见的致病基因[9]，中国学者报道在常染色体隐性遗传的耳聋患者中，约50%由GJB2基因突变引起[10]。迄今为止，已有300多种GJB2基因突变，被报道导可导致隐性非综合征型聋（DFNB1）（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/）。2003年纪育斌等[11]通过对中国非综合征型聋病患者GJB2基因突变的流行病学进行分析，发现我国GJB2基因突变最常见的4种类型分别为c.235delC、c.299delAT、c.176del16和c.35delG，在我国耳聋人群中，这4个位点的突变率分别为11.90%、2.22%、0.65%和0.27%。值得注意的是，p.V37I位点突变在亚洲人群中的突变率也很高[2]。多项研究发现p.V37I突变表现为轻度至极重度听力损失，轻-中度听力损失所占比例超过60%[4,12]。吴皓等[13]的研究发现GJB2基因p.V37I突变在汉族迟发性听力损失患儿组中的发生率为20%，远高于听力正常儿童组，提示p.V37I突变与迟发性听力损失关系密切。2012年，北京率先开始在本市实施常驻人口的耳聋基因筛查项目，对GJB2基 因 c.235delC、c.299delAT、c.176del16和c.35delG位点突变进行筛查，筛查结果为GJB2基因单杂合突变患儿可于听力诊断机构进行GJB2基因全外显子测序，c.235delC/p.V37I、c.299delAT/p.V37I等复合杂合突变患儿的检出日益增多，本研究通过对41例GJB2基因p.V37I位点突变儿童的临床听力学特点进行分析，探讨p.V37I杂合突变的临床意义，为遗传咨询提供临床依据。

3.1 基因检测结果

GJB2基因在内耳中的正常表达是内耳感觉细胞和支持细胞间进行离子和信息传递的基础，对内耳发育和听觉形成至关重要，不同种族，基因突变谱系不同。GJB2基因突变在北欧犹太教徒、高加索人中，出现频率较多的基因位点突变分别是c.35delG、c.167delT和c.235delC[14]。在亚洲，c.235delC是最常见的位点突变，突变率为5～22%[15-17]，p.V37I在中国汉族人群中的携带率也很高，Li等报道为6.2%[2]。Dai[18]等报道在2063例非综合征性感音神经性聋患者中，p.V37I纯合突变检出率为6.8%，与正常对照组的差异有统计学意义，认为p.V37I突变具有致病性。本课题组前期对915例GJB2基因筛查为单杂合突变的新生儿进行测序，发现p.V37I突变检出率为4.04%[19]。本研究对检出的p.V37I杂合突变不同基因型进行统计，发现最常见基因型为c.235delC/p.V37I，占61.0%（25/41），其次为 c.299delAT/p.V37I，占31.7%（13/41），c.176del16/p.V37I，占7.3%（3/41），未检出c.35delG/p.V37I，与文献报道基本一致。

3.2 听力筛查情况

Wu[20]等使用DPOAE或AABR，对62名基因型为p.V37I/p.V37I的新生儿及16名基因型为p.V37I/c.235delC的新生儿进行听力筛查，通过率分别为51.6%和62.5%，本研究新生儿听力筛查通过率为31.7%（13/41），其中 p.V37I/c.235delC通过率为28.0%（7/25），低于上述报道，可能与基因型、新生儿听力筛查方式、筛查人员技术等因素有关。此外，Li[2]等对173名听力筛查未通过，之后确诊为听力正常的儿童进行基因检测，发现p.V37I突变检出率为5.8%（10/173），远高于听力筛查通过组（0.14%），认为p.V37I复合杂合突变儿童在出生时可能存在亚临床或交界性听力损失。本研究有7例儿童（17.1%，7/41）听力筛查未通过，之后确诊为听力正常，考虑除上述研究提出的原因外，可能与部分新生儿在接受听力筛查时耳蜗毛细胞发育相对不完善，影响耳声发射的测试结果；或部分新生儿在接受听力筛查时存在中耳积液等因素有关，因样本量较少，需扩大样本量，对原因进行深入探讨。

3.3 听力诊断情况

Wu等[20]对35名基因型为c.235delC/p.V37I的受试儿进行听力随访，发现1岁时，54.2%（19/35）的受试儿听力程度＜25dB HL，提示GJB2基因c.235delC/p.V37I复合杂合突变有一定非外显率，本研究受试者于3月龄后进行听力诊断，听力正常16人(39.0%，16/41)，略低于Wu的报道，分析原因，可能为本研究入组对象基因型不同有关。除c.235delC/p.V37I外，本研究还包含c.299delAT/p.V37I、c.176del16/p.V37I基因型，不同基因型在听力诊断时具有听力表型的差异。诸多研究表明，p.V37I突变与轻度至中度听力损失密切相关[4,12]，本研究结果显示，轻度听力损失14人（34.1%，14/41），中度听力损失11人（26.8%，11/41），无重度、极重度感音神经性聋者，与文献报道一致。值得注意的是，通过对不同基因型儿童的听力诊断情况进行分析，发现c.299delAT/p.V37I突变儿童听力损失10人（76.9%，10/13），听力损失程度以中度为主，提示c.299delAT/p.V37I突变儿童出现听力损失可能性较c.235delC/p.V37I及c.176del16/p.V37I突变儿童大且听力损失程度更重，需要扩大样本量，进行临床深入研究。本研究3名（8.82%，3/34）儿童通过听力筛查，在3月龄后听力诊断时，出现双侧轻度听力损失，提示其可能发生迟发性听力损失，与以往报道相同[13]。3组基因型听力曲线均以平坦型为主，U型与上升型较少，与代志瑶等[21]对GJB2基因突变阳性者听力曲线类型的报道基本一致。

研究发现，本组GJB2基因p.V37I杂合突变儿童，基因型以c.235delC/p.V37I为主，61.0%出现轻-中度听力损失。4例儿童通过新生儿听力筛查，之后出现听力损失，提示GJB2基因p.V37I突变与迟发性听力损失相关。基因型为c.299delAT/p.V37I的儿童出现听力损失可能性较大，临床应予以重视。