血浆抗凝血酶和炎症meijiangneirong平分析

宋孝鹏

洛阳北方企业集团有限公司职工医院内科(河南 洛阳 471000)

脑梗死是因急性缺血、缺氧导致的局部或弥漫性脑组织损伤的血管性事件，发病率和致死率位列我国前三[1]。研究发现，体内凝血和抗凝系统平衡失调在脑梗死发病过程中发挥着重要的促进作用[2]。

血浆抗凝血酶(AT-Ⅲ)是具有丝氨酸酶抑制活性的糖蛋白，可调节血浆生理性凝血功能[3]。相关研究显示，炎症与凝血系统之间存在明显相互作用，促炎因子是主要桥梁[4]。本研究通过检测110例脑梗死患者血浆AT-Ⅲ活性和TNF-α、IL-6水平，探讨其在脑梗死病情发展中的作用。

1 对象与方法

1.1研究对象 收集2016年3月至2017年10月间本院神经内科收治的脑梗死患者110例为研究组。均经CT或MRI确诊为脑梗死，NIHSS评分>2分，从发病到采集血标本的时间间隔≤48h。其中男性70例，女性40例，年龄32～81岁，平均(65.38±9.72)岁。选取同期在本院体检的健康人群110例为对照组，其中男性60例，女性50例，年龄30～78岁，平均(64.51±6.93)岁。两组受试者一般资料间差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准，均签署知情同意书，且排除1个月内有手术史、外伤史、口服避孕药，合并肾病综合征、血液系统疾病、肝病的受试者。

1.2方法

1.2.1 标本采集与制备

抽取受试者清晨空腹肘静脉血，部分全血用于分离外周血单核细胞，具体为：Hanks液稀释1倍后加入淋巴细胞分离液，收集单核细胞层，用含血清的DMEM培养液调整细胞浓度至1×1010/L；加入96孔板中，200μL/孔，培养过夜，弃去悬浮细胞，贴壁细胞为单核细胞。另取3.6mL全血加入枸橼酸钠0.4mL抗凝管中，离心收集血浆，测定AT-Ⅲ活性；取肝素抗凝血浆，分别检测免疫复合物、THF-α、IL-6以及常规生化项目。

1.2.2 血生化指标检测

迈瑞普利生全自动血凝仪C2000-A检测AT-Ⅲ活性，配套试剂(凝血酶、底物、凝血酶溶剂)购于上海威奥生物科技有限公司。全自动生活分析仪检测空腹血糖、血脂四项、同型半胱氨酸水平。使用EIA试剂盒检测血浆免疫复合物水平，Elisa法检测血浆TNF-α、IL-6水平，试剂盒购于上海仁捷生物科技有限公司。

1.2.3 单核细胞数量和表型检测

取对数期单核细胞，缓冲液重悬细胞，分别经CD14、CD16、CD32、CD64单克隆荧光抗体染色，上流式细胞仪检测单核细胞数量和表型。使用GraphPadPrsim5软件定量分析单核细胞表面分子表达情况。

1.2.4 免疫复合物刺激单核细胞后TNF-α、IL-6检测

12孔板中加入1mL人类IgG孵育过夜，磷酸缓冲液洗涤后，与800μL的小鼠抗人IgG共孵育60min。制备好的孔板加入外周血单核细胞之前用磷酸缓冲液洗涤。将单核细胞加入不同浓度Ig-IC复合物(0～1000mg/L)的12孔板中培养16h，离心取上清液，Elisa法测定TNF-α、IL-6浓度，以人类IgG为对照。

2 结果

2.1两组患者血浆AT-Ⅲ活性水平及临床资料比较 研究组患者血浆AT-Ⅲ活性为(85.83±9.26)%，低于对照组的(98.24±10.52)%，差异有统计学意义(P<0.05)。研究组患者TC、TG、LDL-C、同型半胱氨酸水平高于对照组，HDL-C水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组患者临床资料比较

注：与对照组相比，aP<0.05

2.2血浆AT-Ⅲ活性与脑梗死危险因素的相关性分析 将血压、空腹血糖、血脂指标、同型半胱氨酸为自变量，血浆AT-Ⅲ活性为因变量，进行线性相关性分析，结果显示，脑梗死患者血浆AT-Ⅲ活性与收缩压、舒张压、空腹血糖、TC、TG、LDL-C、同型半胱氨酸呈负相关(r=-0.29、-0.46、-0.38、-0.86、-0.72、-0.91，P<0.05)；与HDL-C呈正相关(r=0.57，P<0.05)。

2.2血浆免疫复合物及TNF-α、IL-6水平比较 研究组血浆免疫复合物水平为高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；研究组TNF、IL-6水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 两组血浆免疫复合物及TNF-α、IL-6水平比较

注：与对照组相比，aP<0.05

2.3外周血单核细胞表面标志物水平比较

流式细胞术检测显示，CD14+CD16+、CD14+CD32+单核细胞比例在两组间差异无统计学意义(P>0.05)；研究组CD14+CD64+单核细胞比例高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 两组外周血单核细胞表面标志物水平比较

注：与对照组相比，aP<0.05

2.4免疫复合物刺激对外周血单核细胞TNF-α、IL-6分泌的影响 加入的Ig-IC复合物浓度在0mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L时外周血单核细胞TNF-α、IL-6的分泌量均随着Ig-IC复合物浓度的增加而提升。见表4。

表4 免疫复合物刺激对外周血单核细胞TNF-α、IL-6分泌的影响

3 讨论

脑梗死发病过程中，血管病变引发内膜损伤形成溃疡，血小板等血液中有形成份聚集并释放出促凝因子，同时胆固醇、脂蛋白等含量增加，导致血粘度升高，血流速变慢，脑组织出现局部缺血症状。因此，脑梗死的发生与凝血系统和抗凝系统平衡失调有关。AT-Ⅲ为肝脏合成的糖蛋白，具有丝氨酸酶抑制活性，作用于多种含丝氨酸酶凝血因子的活性中心，是体内抑制凝血的关键物质，维持抗凝和纤溶系统与凝血系统的平衡状态，约占血浆抗凝血酶活性的60%[5]。本研究中脑梗死患者血浆AT-Ⅲ活性下降，与凝血功能亢进及相关酶大量消耗有关。脑梗死危险因素与血浆AT-Ⅲ活性相关性分析显示，血压、空腹血糖、TC、TG、LDL-C、同型半胱氨酸呈负相关，与HDL-C呈正相关，提示血浆AT-Ⅲ活性检测有助于脑梗死病情防治。近年来大量研究显示，炎症与凝血系统存在明显关联，其中促炎因子发挥重要桥梁作用[6]。TNF-α多由T细胞、巨噬细胞分泌，参与局部炎症反应，在凝血系统激活中发挥调节作用；IL-6是可激活凝血系统的促炎因子。本研究显示，脑梗死患者血浆TNF-α、IL-6水平高于健康对照组，可能与血浆AT-Ⅲ活性下降有关。炎症反应是脑组织血管硬化斑块形成的主要病理基础[7-8]。组织病理学检查显示，斑块中存在巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞的相互作用，在动脉硬化及斑块不稳定性炎症过程中发挥重要作用[9-10]。本研究中也发现脑梗死患者血浆病理产物的免疫复合物水平明显高于对照组，为进一步分析细胞因子和免疫反应在脑梗死患者血浆AT-Ⅲ活性变化中的作用，本研究分离了患者外周血单核细胞，检测其表面标志物结果显示，研究组CD14+CD64+单核细胞比例高于对照组，提示脑梗死患者体内免疫复合物可能通过结合CD14+CD64+单核细胞，分泌大量促炎细胞因子，改变AT-Ⅲ活性。为进一步验证上述结论，探讨AT-Ⅲ在脑梗死患者中变化的机制，本研究在体外模拟了免疫复合物，观察不同浓度免疫复合物对外周血单核细胞TNF-α、IL-6分泌的影响，结果显示，随着免疫复合物浓度的增加，TNF-α、IL-6分泌水平明显升高，提示血液中受刺激的单核细胞是脑梗死患者体内高水平的促炎因子的主要来源，可不同程度低损伤血管内皮细胞，降低抗凝因子合成量，可能为血浆AT-Ⅲ活性降低的原因。

综上所述，脑梗死患者血浆AT-Ⅲ活性明显下降，是脑梗死发生、发展的危险因素之一，且与病情严重程度相关，可作为脑梗死临床诊治的参考指标。其可能机制为免疫复合物经CD14+CD64+单核细胞介导促炎因子分泌，损伤血管内皮细胞，抑制AT-Ⅲ合成。