艾拉莫德对功能退变椎间盘细胞炎症因子表达的影响

王宇翔，徐海栋

0 引 言

颈椎病、腰椎间盘突出及腰椎管狭窄等脊柱功能退变性疾病作为常见且多发的疾病，造成了严重的社会和经济负担［1-3］。椎间盘功能退变通常表现为椎间盘髓核水分的丢失、纤维环的破裂及髓核的突出、椎间盘高度的丢失，往往会导致椎间盘源性腰痛，并出现椎间盘突出和继发性椎管狭窄相关的神经压迫症状［4］。

目前研究认为，炎症因子的过量表达导致的椎间盘细胞外基质的减少以及髓核细胞的凋亡是造成椎间盘功能退变的主要原因［5］。众多炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、COX-2、PGE等较正常的椎间盘表达升高。其中TNF-α是目前研究最多、强有力的炎性细胞因子。研究发现，TNF-α和其相应的受体在正常的椎间盘和功能退变的椎间盘中都有表达，并且上调降解酶［基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和 ADAMTS］mRNA 的表达导致细胞外基质的降解，使得细胞基质合成减少［6］。其中MMPs家族在椎间盘功能退变过程中高表达，在细胞外基质降解中起着最直接的作用。

艾拉莫得是一种新型的治疗类风湿疾病的药物［7-8］。大量研究证据发现，艾拉莫得能够抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17以及NF-κB等炎症因子在类风湿关节炎患者的滑膜细胞和人单核细胞中的表达［9-10］。目前艾拉莫德多用于风湿性关节炎的相关研究，也有关于其抑制肝细胞癌变、预防免疫性肾炎的报道［11-12］，但对于椎间盘功能退变的作用尚无相关研究。本研究旨在评估艾拉莫德对功能退变椎间盘的髓核细胞炎症因子表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验方法

1.1.1 大鼠椎间盘髓核细胞的分离和培养选用8～12周龄SD大鼠共60只，体重在650～800 g，雌雄不限，动物实验许可证号：SYXK（军）2012-0047。随机分为加压组和对照组，每组30只。加压组用外固定加压装置加压大鼠尾部6～8周；将腹腔注射水合氯醛处死的大鼠放入75%乙醇浸泡消毒10 min，严格无菌操作下，用刀片切开大鼠尾巴切开纤维环，在放大镜下，使用尖刀片取出凝胶样的髓核组织；剪碎组织后加入0.25%胰蛋白酶，持续震荡下，于37℃水浴中消化15 min。离心、冲洗后加入0.025%II型胶原酶，于37℃水浴中消化4 h，至仅剩余少量组织碎屑；去除未消化的组织碎屑，细胞悬液1000 r/min，离心5 min，弃上清；髓核细胞重悬后接种于6 cm培养皿，于5%CO2，37℃，饱和湿度的细胞培养箱中；每3天换液一次，当原代髓核细胞生长至80%～90%融合时，按照1∶3比例传代扩增，至第2代。分离培养大鼠退变椎间盘的髓核细胞。对照组大鼠不加压处理。本研究所用于实验的髓核细胞均为第2代。

1.1.2 髓核细胞表型鉴定待第1代髓核细胞生长至80%～90%融合时，消化传代接种至铺有细胞爬片的6孔细胞培养板中，于5%CO2，37℃，饱和湿度的细胞培养箱中培养。倒置显微镜下确认细胞爬片上的第2代髓核细胞生长至80%～90%融合时，弃去培养基。用4%多聚甲醛室温下固定细胞6 h。分别用0.1%Triton X-100、3%过氧化氢室温下处理细胞后，加入2%BSA，37℃封闭1 h。加入抗大鼠II型胶原和Aggrecan的一抗4℃孵育过夜。然后加入荧光二抗（1∶100）室温下孵育1 h。在共聚焦显微镜（日本Olympus）下观察荧光图像（波长=594 nm），并拍照记录。

1.1.3 艾拉莫德细胞毒性检测在髓核细胞中分别加入不同浓度的艾拉莫德（0、0.3、30、50、100、150 μg/mL），于5%CO2，37 ℃，饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h。然后加入CCK-8试剂10 μL，于5%CO2，37℃，饱和湿度的细胞培养箱中培养2 h。以空白培养基为空白对照，使用酶标仪检测在450 nm波长处的吸光度。并按公式计算细胞活力。

1.1.4 髓核细胞炎症因子和MMP的分泌测定根据ELISA试剂盒说明书梯度稀释IL-6标准品，分别加入酶标包被板中，再依次加入IL-6抗体10 μL、链霉素亲和素-辣根过氧化酶50 μL，37℃孵育1 h。冲洗酶标包被板5次后依次加入显色液A和显色液B各10 μL，避光常温孵10 min。使用酶标仪检测各孔在450 nm波长处的吸光度；以只加显色液和终止的孔为空白对照，建立标准曲线（3个复孔）。收取各孔内的培养基，4000 r/min离心10 min取上清，按照以上步骤使检测样品培养基在450 nm波长处的吸光度，根据标准曲线，检测IL-6在培养基中的含量。同法使用ELISA试剂盒测定TNF-α、MMP-3、MMP-9、IL-8、NF-KB在养基中的含量。

1.1.5 实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测炎症相关基因表达将髓核细胞置于5%CO2，37℃，饱和湿度的细胞培养箱中培养。生长至80%～90%融合时，更换培养基，分别加入不同浓度的艾拉莫得（0、0.3、3、10、20、30 μg/mL），于5%CO2，37℃，饱和湿度的细胞培养箱中培养2h。提取细胞总RNA后逆转录合成cDNA。按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书配制Real-time PCR反应体系，轻柔震荡混匀体系。配制的Real-time PCR反应体系于实时荧光定量PCR仪（ABI-7500）反应检测相应Ct值，使用β-actin作为内参，使用标准的2-ΔΔCt计算各目标基因相对表达量。

1.2 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行数据分析。计量数据以均数±标准差（±s）表示，组间均值比较采用方差分析，两两组间比较采用LSD法。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 加压功能退变模型椎间盘病理表现对照组大鼠椎间盘可见髓核及纤维环形态学基本正常；而加压组大鼠髓核组织明显减少，外层纤维环组织紊乱、断裂。退变椎间盘细胞炎症环境建立成功，后续实验采用加压组大鼠进行分析。见图1。

图1 大鼠椎间盘病理改变（HE×40）Figure 1 Pathological changes in the intervertebral disc of the rat model of disc degeneration（HE ×40）

2.2 髓核细胞形态观察和表型鉴定显微镜下可见髓核细胞散在形成簇状的圆形或椭圆型的细胞。原代髓核细胞贴壁很缓慢，培养至2 d左右，大部分原代髓核细胞贴壁扩展为圆形或短梭型，细胞体积较大，细胞质丰富，细胞界限清晰，可见细胞质内囊泡。大鼠髓核细胞II型胶原免疫荧光检测和Aggrecan免疫荧光检测均呈明显阳性，见图2。

图2 大鼠髓核细胞形态观察和表型鉴定Figure 2 Morphology and phenotypes of the intervertebral disc cells in the rat model of disc degeneration

2.3 艾拉莫德对髓核细胞增殖活力影响的分析CCK-8检测结果显示，0.3、30、50 μg/mL艾拉莫德处理髓核细胞24 h，髓核细胞增殖活力与0 μg/mL比较均无明显变化，各组间差异无统计学意义（P＞0.05），100、150 μg/mL与0 μg/mL比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 CCK-8检测艾拉莫德对髓核细胞增殖活力的影响Figure 3 Proliferation of the intervertebral disc cells in the rat model of disc degeneration after treated with different concentrations of iguratimod

2.4 艾拉莫德对髓核细胞炎症因子表达升高的影响3、10、20、30 μg/mL的艾拉莫德处理后，髓核细胞IL-6、TNF-α分泌量及相应基因表达量均呈浓度依赖性降低（P＜0.05）。见表1。

2.5 艾拉莫德对髓核细胞基质金属降解酶表达升高的影响3、10、20、30 μg/mL的艾拉莫德处理后，MMP-2、MMP-3和MMP-9分泌量及相应基因表达量均呈现浓度依赖性降低（P＜0.05）。见表2。

表1 艾拉莫德对髓核细胞炎症因子表达的影响（±s,μg/mL）Table 1 Expressions of inflammatory factors in the intervertebral disc cells of the rat model of disc degeneration after treated with different concentrations of iguratimod（±s,μg/mL）

表1 艾拉莫德对髓核细胞炎症因子表达的影响（±s,μg/mL）Table 1 Expressions of inflammatory factors in the intervertebral disc cells of the rat model of disc degeneration after treated with different concentrations of iguratimod（±s,μg/mL）

与0、0.3 μg/mL比较，*P ＜0.05；与3 μg/mL比较，#P ＜0.05；与10 μg/mL比较，△P ＜0.05；与20 μg/mL比较，☆P＜0.05

细胞因子IL-6(pg/mL)TNF-α(pg/mL)IL-6 mRNA TNF-α mRNA艾拉莫德浓度30 86.31±8.57*#△☆96.89±9.60*#△☆0.20±0.08*#△☆0.23±0.10*#△☆0 241.62±13.96 312.95±12.54 1.00±0.06 1.00±0.07 0.3 203.04±9.08 261.33±8.17 0.76±0.09 0.83±0.11 3 10 122.73±9.38*#132.52±11.46*#0.42±0.07*#0.42±0.08*#20 97.87±7.81*#△101.26±10.38*#△0.48±0.07*#△0.26±0.09*#△204.18±6.96*202.46±7.84*0.64±0.09*0.54±0.09*

表2 艾拉莫德对髓核细胞基质降解酶表达升高的影响（±s,μg/mL）Table 2 Contents of matrix metalloproteinases(MMP)in the intervertebral disc cells of the rat model of disc degeneration after treated with different concentrations of iguratimod（±s,μg/mL）

表2 艾拉莫德对髓核细胞基质降解酶表达升高的影响（±s,μg/mL）Table 2 Contents of matrix metalloproteinases(MMP)in the intervertebral disc cells of the rat model of disc degeneration after treated with different concentrations of iguratimod（±s,μg/mL）

与0、0.3 μg/mL比较，*P ＜0.05；与3 μg/mL比较，#P ＜0.05；与10 μg/mL比较，△P ＜0.05；与20 μg/mL比较，☆P＜0.05

MMP MMP-2(ng/mL)MMP-3(ng/mL)MMP-9(ng/mL)MMP-2 mRNA MMP-3 mRNA MMP-9 mRNA艾拉莫德浓度30 92.49±7.19*#△☆7.87±1.42*#△☆37.19±3.62*#△☆0.23±0.10*#△☆0.25±0.09*#△☆0.22±0.08*#△☆0 292.14±12.03 20.24±1.92 83.81±4.66 1.00±0.06 1.00±0.07 1.00±0.07 0.3 289.45±10.33 18.35±0.85 78.96±6.92 0.86±0.08 0.85±0.09 0.80±0.13 3 10 153.76±12.26*#12.58±1.16*#53.28±8.36*#0.47±0.10*#0.56±0.08*#0.53±0.09*#20 109.33±7.31*#△10.72±1.24*#△42.35±7.60*#△0.58±0.11*#△0.57±0.12*#△0.56±0.11*#△203.84±11.45*13.97±1.59*64.71±7.57*0.65±0.09*0.72±0.08*0.62±0.09*

3 讨 论

细胞外基质的降解是导致椎间盘结构和功能破坏的最直接病理过程，往往作为炎症反应的一种具体表现，使椎间盘功能退变逐渐进展。正常椎间盘在受到过度的机械应力或生物化学刺激时，椎间盘内炎症反应启动，包括IL-6、IL-1β和TNF-α在内的多种炎症因子表达升高［13］。一方面诱导椎间盘细胞内MMP家族和ADAMTS家族基质降解酶类的增加，加快细胞外基质降解过程；另一方面，也抑制椎间盘细胞外基质合成，减少新生的细胞外基质［14］。

相关研究证明过度的机械性载荷或各种炎症因子刺激均可诱导椎间盘内炎症反应［15］。本研究利用外固定加压装置对大鼠尾部持续静态加压，诱导椎间盘功能退变。Iatridis等［16］发现固定加压组较单纯固定组椎间盘功能退变明显，蛋白聚糖含量显著减少。Kroeber等［17］加压后发现椎间盘体积明显变小及纤维环结构紊乱，同时观察到椎间盘纤维环和终板的细胞死亡量增多。虽然加压模型无法完全模拟人体真实椎间盘功能退变过程，但本研究结果已证明加压模型可以诱导SD大鼠椎间盘功能退变，使髓核细胞炎症因子高表达，诱导髓核细胞基质金属蛋白酶高表达。

本研究中艾拉莫德干预培养功能退变椎间盘细胞后IL-6，TNF-α表达显著下降，且下降程度与浓度相关，提示了其在髓核细胞内有效的抗炎作用。IL-6和TNF-α等炎症因子始终为各类炎症反应中的重要介质，在多种细胞组织中都介导了炎症反应，而且在椎间盘功能退变中发挥着重要作用［18-20］。Studer等［21］发现IL-6处理人椎间盘细胞，基质金属蛋白酶（MMP-3，13）合成显著增加，而蛋白多糖及胶原蛋白生成则明显减少。Ohba等［22］研究发现，TNF-α可以诱导IL-6，IL-8等炎症因子在椎间盘中的表达，而且还促进MMP、纤溶酶、尿激酶的合成。Kohno等［19］在实验中用TNF-α诱导滑膜细胞高表达IL-6，IL-8后用艾拉莫德干预，IL-6，IL-8的表达显著降低。上述研究与本研究结果均一致。

MMP家族是椎间盘功能退变中主要的细胞外基质降解酶，可将椎间盘基质的主要成分II型胶原和蛋白聚糖降解，从而破坏椎间盘的生理结构和功能［23-24］。本研究将MMP家族作为关键性的椎间盘基质降解相关指标，结果显示艾拉莫德可以显著抑制退变髓核细胞中MMP-2、MMP-3、MMP-9的表达。本研究探索艾拉莫德可能的抗炎机制，相关的荧光素酶报告基因检测和ELISA检测显示，对NF-κB有着显著的抑制作用，而且这种作用呈现出一定的浓度依赖性。Gan等［25］报道艾拉莫德可通过NF-κB和MAPK途径抑制RANKL诱导的破骨细胞的分化和迁移；Wei等［26］报道可通过艾拉莫德抑制IL-6诱导的RANKL、IL-7和MMP-3表达的抑制作用，因此对于髓核细胞炎症因子表达的抑制是否同样通过多途径进行作用，对IL-6和MMP-3的抑制是否存在级联效应仍需要进一步研究。

综上所述，本研究显示在体外培养条件下，艾拉莫德显著抑制了髓核细胞炎症因子的表达升高，阻断了炎症反应的进程，达到了延缓椎间盘早期功能退变的目的，为逆转退变的趋势彻底解决椎间盘功能退变的问题提供了新的可能。