Ubi-p63E基因在果蝇睾丸生殖干细胞微环境中的功能研究

周美云，郑倩雯，栾晓瑾，颜一丹，陈万银，王 敏，谢 冰，乔 晨，方 杰，于 骏，陈 霞

0 引 言

干细胞内环境的稳态平衡对细胞和组织发育至关重要，它们可以通过自我更新和分化过程调控细胞命运［1-2］。果蝇睾丸中存在两种不同类型的干细胞，包括生殖干细胞（germline stem cells，GSCs）和体细胞干细胞（somatic stem cells，SSCs），对维持GSCs的细胞命运和分化过程都具有极为重要的作用［3］。GSCs微环境可以维持GSCs和SSCs的存活。有研究表明，GSCs可以通过不对称分裂的方式分化为精原细胞，并经过精母细胞、圆形精子、长形精子的分化过程，最终形成精子细胞［4］。而SSCs可以分化为成熟的包囊细胞，对生殖细胞的增殖、生长和分化提供微环境［3］。

果蝇睾丸GSCs的自我更新和分化过程受到细胞内源信号和细胞外信号的严格调控［4-5］。目前已经证实了一些经典的信号通路（如JAK-STAT、Hedgehog等）可以调控果蝇睾丸GSCs的自我更新和分化过程，但其调控机制仍非常不清楚，因此亟需进一步探索其调控网络来阐明人非梗阻性无精子症和睾丸生殖细胞肿瘤的致病机制。在我们前期的研究中［6］，通过果蝇UAS-Gal4系统进行大规模果蝇睾丸RNA干扰（RNA interference，RNAi）筛选，共发现了221个GSCs调控因子，而这些GSCs调控因子在果蝇睾丸GSCs微环境中发挥了多样的作用。在这些鉴定到的调控因子中，不乏已经被证实参与睾丸生殖细胞肿瘤发生的关键基因（如bɑm、tut等）［7-9］。

泛素是一种很小的蛋白质（包含76个氨基酸），并在所有的真核生物中高度保守。泛素可以通过与其他蛋白质共价结合，以多种方式修饰蛋白质活性。泛素以融合蛋白的方式进行表达，通常表现为多泛素，或者与核糖体蛋白L40和S27a相结合［10-11］。通过分析，我们推测Ubi-p63E基因可能是一个重要的GSCs微环境调控因子。Ubi-p63E基因编码的蛋白是一个多泛素化前体蛋白，该蛋白被去泛素酶处理后可以分解为多个泛素化分子。它们主要与对应的靶蛋白相关结合，参与调控了蛋白质降解、细胞自噬、细胞程序性死亡、等多种生物学过程［12］。本研究主要以Ubi-p63E基因为切入点，综合运用遗传学、组织形态学等技术手段，对Ubi-p63E基因的生物学功能进行深入的分析，探讨其在睾丸GSCs微环境中调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 果蝇品系UAS-Ubi-p63E RNAi转基因果蝇从清华果蝇中心（Tsinghua Fly Center，THFC）购得，该品系来源于TRiP RNAi转基因果蝇库（Transgenic RNAi Project）。Gɑl4转基因果蝇品系信息如下：nos-Gɑl4（BDSC，#4937），tj-Gɑl4（DGRC，#104055）。W1118品系果蝇为野生型果蝇，作为对照组果蝇使用，来源于THFC果蝇库。所有果蝇均在稳定的环境中进行饲养：保种果蝇和实验用果蝇均在温度25℃、相对湿度60%的条件下饲养。本研究经江苏大学附属医院生物医学伦理学委员会批准。

1.1.2 主要试剂和仪器（生工生物工程股份有限公司，中国），免疫荧光一抗Vasa（Santa Cruz Biotechnology，美国），免疫荧光一抗 Eya（Developmental Studies Hybridoma Bank，美国），免疫荧光一抗DE-cad（Developmental Studies Hybridoma Bank，美国），免疫荧光一抗FasIII（Developmental Studies Hybridoma Bank，美国），免疫荧光一抗1B1（Developmental Studies Hybridoma Bank，美国），免疫荧光一抗PH3（Cell Signaling Technology，美国），免疫荧光488-兔二抗、cy3-小鼠二抗、647-大鼠二抗（Molecular Probes and Jackson Immunologicals公司，美国），Hoechst 33342（Invitrogen，美国），激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss Lsm710，德国），4℃离心机（Eppendorf，德国），28℃恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司，中国），精细镊子（Roboz，美国）。

1.2 方法

1.2.1 果蝇杂交策略挑选GAL4品系（nos-GAL4或者tj-GAL4）雄性果蝇与UAS-Ubi-p63E RNAi品系的处女果蝇杂交。在F1代中挑选特定基因型（nos＞Ubi-p63E RNAi和tj＞Ubi-p63E RNAi）的果蝇用于功能学分析。在本研究中，W1118品系果蝇为对照组，nos＞Ubi-p63E RNAi组（早期生殖细胞中敲减Ubip63E基因）和tj＞Ubi-p63E RNAi组（包囊细胞中敲减Ubi-p63E基因）果蝇为实验组。

1.2.2 生育率测试在F1代果蝇中挑选单只特定基因型（Gal4＞UAS-Ubi-p63E RNAi）的成年雄蝇与3只野生型（W1118）处女蝇杂交，观察其是否可以获得后代果蝇。本实验共选取对照组果蝇73只，nos＞Ubip63E RNAi组果蝇113只，以及tj＞Ubi-p63E RNAi组果蝇97只。通过统计F1代单只雄性果蝇生育比例来判断雄性果蝇生育能力。

1.2.3 免疫荧光染色本实验共选取对照组果蝇23只，nos＞Ubi-p63E RNAi组果蝇 31 只，以及 tj＞Ubip63E RNAi组果蝇17只。取特定基因型的果蝇睾丸，用4%多聚甲醛固定20 min后，用含0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）的PBS清洗睾丸3次，10 min/次，5%的牛血清白蛋白封闭30 min，加入一抗于4℃冰箱孵育过夜后再用含0.1%TritonX-100的PBS清洗3遍，除去未结合的一抗，再用相应的二抗在室温孵育1h，最后用含0.1%TritonX-100的PBS清洗，去除多余的二抗，将睾丸置于普通载玻片上，用30 μL 1.0 mg/mL的Hoechst33342染DNA 5 min，加入20 μL80%甘油，盖上盖玻片封片。果蝇睾丸免疫荧光图片通过共聚焦激光显微镜采集，图片处理采用Adobe Photoshop CS5。

在果蝇睾丸中，Vasa抗体可以标记生殖细胞，眼缺陷蛋白（eyes absent，Eya）可以标记成熟的包囊细胞，黏附蛋白DE-cad是中心细胞核和包囊细胞的标记物，1B1抗体可以标记生殖细胞间的融合体，FasIII抗体可以标记中心细胞，而PH3作为细胞增殖的标记物，在正常果蝇睾丸的早期生殖细胞中仅有少量表达。

1.3 统计学分析采用SPSS19.0软件进行统计分析，定性资料表达采用百分比（%），组间比较采用卡方检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Ubi-p63E基因的生育率测试生育率测试结果表明，与对照组生育率（97.26%）相比，nos＞Ubip63E RNAi组（0%）和tj＞Ubi-p63E RNAi组生育能力（4.12%）明显降低（P＜0.01）。

2.2 在早期生殖细胞中敲减Ubi-p63E基因影响生殖细胞的细胞维持功能与对照组相比，nos＞Ubip63E RNAi组和 tj＞Ubi-p63E RNAi组睾丸形态明显异常，长度分别为对照组的22.77%、18.86%，均出现小睾丸的表型，见图1。

图1 镜下观察果蝇睾丸形态（×40）Figure 1 Morphology of the Drosophila testes under the light microscope（×40）

与对照组睾丸相比，nos＞Ubi-p63E RNAi睾丸长度明显变短，睾丸中的GSCs完全消失（与中心细胞相邻的细胞为Vasa阴性细胞），剩余的生殖细胞也几乎完全消失，睾丸出现结构性塌陷，进而出现包囊细胞的代偿性增生（Eya阳性细胞明显积累）。见图2。

2.3 在包囊细胞中敲减Ubi-p63E基因影响生殖细胞的分化功能免疫荧光染色结果显示，与对照组睾丸比较，tj＞Ubi-p63E RNAi组正常睾丸形态消失，且出现较多异常的细胞团块。这些细胞团大多为Vasa阳性细胞，而1B1标记的融合体完全呈现点状分布，见图3。

与对照组睾丸相比，tj＞Ubi-p63E RNAi组睾丸中的未分化生殖细胞团块失去了中心细胞的调控，均出现PH3阳性的增殖细胞，见图4。

图2 在早期生殖细胞中敲减Ubi-p63E基因的睾丸表型分析（免疫荧光染色×400）Figure 2 Phenotypes of the Drosophila testes with knockdown of the Ubi-p63E gene in the early germ cells（IF ×400）

图3 在包囊细胞中敲减Ubi-p63E基因的睾丸表型分析（免疫荧光染色×400）Figure 3 Phenotypes of the Drosophila testes with knockdown of the Ubi-p63E gene in the cystoblasts（IF ×400）

图4 未分化的生殖细胞团块的增殖能力分析（免疫荧光染色×400）Figure 4 Proliferation of the undifferentiated germ cell masses in the Drosophila testes（IF ×400）

3 讨 论

睾丸GSCs微环境对于维持正常的GSCs自我更新过程具有非常重要的调控作用，而其调控网络仍不十分清楚。本文报道了Ubi-p63E基因在果蝇睾丸中调控GSCs微环境的作用。本研究在GSCs微环境中使用了两种不同的Gals（即nos-Gal4和tj-Gal4）来驱动Ubi-p63E RNAi的表达。Nos-Gal4主要在GSCs和精原细胞中表达，而tj-GAL4主要在包囊细胞中表达［6，13］。本研究结果提示，Ubi-p63E基因在果蝇睾丸GSCs微环境中发挥了关键作用：Ubi-p63E基因在早期生殖细胞中通过自主性调控方式影响其自我更新过程，并可以利用早期包囊细胞以非自主性的调控方式促进GSCs分化过程。

由于下调Ubi-p63E基因的表达水平可以影响果蝇生殖细胞的命运（绝大部分生殖细胞明显消失，睾丸结构出现塌陷），因此无法对这些睾丸进行干涉效率验证。本研究所用的UAS-Ubi-p63E RNAi品系果蝇来源于TRiP RNAi转基因果蝇库。目前很多重要的果蝇RNAi实验都是通过该果蝇库进行大规模果蝇RNAi筛选，这些研究结果均提示TRiP RNAi转基因果蝇库的脱靶效率是非常低的［6，14-16］。

通过Flybase数据库（http：//flybase.org/）分析发现，Ubi-p63E是果蝇睾丸优势表达蛋白。Ubi-p63E基因编码了一种泛素化蛋白，它可以影响泛素化的稳态平衡。从酵母到哺乳动物，有两种结构的泛素化蛋白是高度保守的（即多泛素化蛋白和单泛素化蛋白），而Ubi-p63E蛋白是果蝇一种多泛素化蛋白。在雄性果蝇中缺失Ubi-p63E基因是可以存活的，其缺陷表型与临床上的人无精子症极为相似［17-18］。Ubi-p63E蛋白可以通过调控精子细胞的分化过程而导致雄性不育［19］。有趣的是，缺失Ubi-p63E基因不影响雌性生育能力，提示它可能是睾丸特异性调控的泛素化蛋白。虽然该研究提示Ubi-p63E基因影响果蝇了精母细胞的分化过程，但是Ubi-p63E基因在果蝇睾丸GSCs微环境中的调控作用尚不清楚。有证据表明，肿瘤细胞内紊乱的泛素化过程可能调控了肿瘤的发生发展过程［20］。本研究对Ubi-p63E基因在GSCs分化障碍和生殖系肿瘤形成等方面的功能注释进行了重要的补充。

目前认为，睾丸生殖细胞肿瘤主要是由于生殖细胞分化和成熟障碍所造成的［18］，其致病遗传因素目前仍不清楚。有证据显示，精原细胞瘤患者在年轻时也存在生育相关问题，这就提示了不育症可能是生殖细胞肿瘤发病的重要风险因素之一［21-22］。果蝇和人睾丸生精过程有很多相似之处。很多人和果蝇的基因突变都有相似的果蝇睾丸表型［2］。与人类相似，果蝇同样可以因为生殖细胞分化障碍和过度增殖而发展成睾丸肿瘤［23］。有研究报道显示，异常的SSCs在果蝇睾丸中可以影响GSCs的分化障碍，并最终介导了生殖细胞肿瘤的发生［6，24］。

综上，Ubi-p63E基因作为一个睾丸优势表达的GSCs调控因子，在GSCs微环境中发挥了重要的作用，主要调控了GSCs的自我更新和分化过程。我们的研究揭示了Ubi-p63E基因在果蝇睾丸中的生物学功能，阐明了睾丸GSCs微环境如何影响精子发生过程和调控睾丸生殖细胞肿瘤形成，为深入理解人非梗阻性无精子症和睾丸生殖细胞肿瘤的发生及调控机制提供重要的理论依据，同时也为临床早期精准诊断和早期防治提供新思路。