稳定靶向干扰长链非编码RNA BC002811胃癌SGC-7901细胞株的构建

林小聪，陈小谊，余华军，兰柳波，符伟玉

0 引 言

蛋白编码基因在人类基因组上仅占全部基因组序列的1.5%～2%，其他的非编码基因在转录后生成大量的非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）分子［1］。根据其转录本长度，ncRNA可分为短链非编码RNA和长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）两大类［1-2］。lncRNA是片段长度＞ 200个核苷酸的一类内源性单链RNA分子，不具备编码蛋白质的能力［2］。研究表明，lncRNA在胃癌中存在广泛的表达失调；多种lncRNA可作为癌基因或抑癌基因在胃癌发病机制中起重要作用，可能成为胃癌潜在的诊断标志物和治疗靶点［1-2］。

既往研究利用lncRNA芯片从胃癌患者的癌组织及其配对癌旁组织样本中筛选出大量差异表达的lncRNA分子；发现其中一种lncRNA BC002811在胃癌组织中呈明显的表达上调［3］。短发夹结构RNA（short hairpin RNA，shRNA）是根据小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）序列设计合成的一种具有紧密发夹环结构的RNA分子，其所介导的基因沉默效果强于siRNA。但目前尚无相关研究报道shRNA载体所介导的BC002811沉默效应。为了阐明BC002811在胃癌中的生物学功能及其作用机制，本研究构建靶向干扰BC002811的重组慢病毒载体，并筛选出稳定低表达BC002811的SGC-7901细胞株，为后续的功能实验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料pLVX-shRNA2载体（美国Clontech公司），慢病毒包装质粒pHelper 1.0和pHelper 2.0（广州莱德联康生物科技有限公司），慢病毒的包装细胞HEK293T、胃癌SGC-7901细胞（由本实验室保存），DH5α感受态细胞（北京鼎国昌盛生物技术有限公司），DMEM培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清（美国Hyclone公司），Trizol试剂、Lipofectamine™RNAiMAX、LipofectamineTM2000、Opti-MEM培养基（美国Invitrogen公司），限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI（上海碧云天生物技术有限公司），T4 DNA连接酶（日本TaKaRa公司），高纯质粒小量提取试剂盒（广州东盛生物科技有限公司），DNA凝胶回收试剂盒（广州东盛生物科技有限公司），M-MLV反转录酶（美国Promega公司），qPCR试剂盒（美国Invitrogen公司），MTS试剂（美国Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养人胚肾HEK293T细胞使用DMEM完全培养基，人胃腺癌SGC-7901细胞使用RPMI-1640完全培养基，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中进行培养。DMEM和RPMI-1640完全培养基均含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。

1.2.2 siRNA转染SGC-7901细胞SGC-7901细胞接种于6孔板中，2×105/孔，待细胞融合度达到40%～50%时，加入Lipofectamine™RNAiMAX以及100 nmol/L针对BC002811的siRNA序列（SIGMA公司合成）进行细胞转染。实验根据不同BC002811 siRNA转染SGC-7901细胞分为siRNA-1组（siRNA-1正义链及反义链）、siRNA-2组（siRNA-2正义链及反义链）、siRNA-3组（siRNA-3正义链及反义链）、对照组（siRNA-NC正义链及反义链），取SGC-7901细胞内对BC002811表达抑制效果最明显的siRNA序列构建shRNA，定义为shRNA组。干扰BC002811表达的siRNA序列如下：siRNA-1正义链：5′-CUCCUGACCUCAGUUCAUCTT-3′，siRNA-1反义链：5′-GAUGAACUGAGGUCAGGAGTT-3′；siRNA-2正义链：5′-GAAUAUUGAGGGACAGAAATT-3′，siRNA-2反 义 链：5′-UUUCUG UCCCUCAAUAUUCTT-3′；siRNA-3 正 义 链 ：5′-CUACCAUCAUACCUGGCU ATT-3′，siRNA-3 反 义 链 ：5′-UAGCCAGGUAUGAUGGUAGTT-3′；siRNA-NC 正义链：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，siRNA-NC反义链：5′-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3′。

1.2.3 实时荧光定量PCR(qPCR)检测Trizol法提取SGC-7901细胞总RNA；按M-MLV反转录酶说明书进行反转录反应，合成cDNA；qPCR检测细胞内BC002811的表达水平，内参照为U6 snRNA。qPCR所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。BC002811 上 游 引 物 ：5′-GATGAGAAAGCCAAGTTCCA-3′，下游引物：5′-GGTTGACAATCAGTATGGAC-3′；U6 snRNA上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性10 s，60°C 退火及延伸60 s，40个循环。应用2－△△Ct法计算BC002811的相对表达水平。

1.2.4 BC002811 shRNA慢病毒载体的构建及鉴定取SGC-7901细胞内对BC002811表达抑制效果最明显的siRNA序列，按照“BamHⅠ酶切位点＋siRNA正义链＋Loop环序列＋siRNA反义链＋EcoRⅠ酶切位点”的原则进行BC002811的shRNA基因序列设计。构建慢病毒载体的shRNA基因序列如下：BC002811 shRNA正义链：5′-GATCCCTCCTGACCTCAGTTCATCTCAAGAGGATGAACTGAGGTCA GA GTTTTTTTG-3′，BC002811 shRNA 反 义 链 ：5′-AATTCAAAAAAACTCCTGACCCAGTTCATCCTCTTGAGATGAACTGAGGTCAGGAGG-3′；shRNA-NC正义 链 ：5′-GATCCTTCTCCGAACGTGTCACGTTCAAGAGACGTGACACGTTCGGAATTTTTTTG-3′，shRNA-NC反义链：5′-AATTCAAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCTTGAACGTGACACGTTCGGAGAAG-3′。shRNA基因序列正义链和反义链由苏州金唯智生物科技有限公司合成。取等体积的正义链与反义链混合，沸水浴煮沸5 min，72℃保温15 min，然后室温自然冷却，即可获得双链的shRNA基因序列，定义为shRNA组。使用限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI对pLVX-shRNA2载体进行双酶切，回收酶切产物后利用T4 DNA连接酶将其与shRNA基因序列，于16℃连接反应2 h，之后转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。摇菌后，将感受态细胞接种到LB琼脂培养基（含100 μg/mL氨苄青霉素）上，37℃倒置培养16 h。挑选抗性菌落接种于LB液体培养基中进行扩增培养，然后提取质粒进行核酸测序鉴定。

1.2.5 重组慢病毒包装及滴度测定利用脂质体LipofectamineTM2000将BC002811的重组慢病毒质粒（pLVX-shRNA2-BC002811 shRNA）与2种病毒辅助包装质粒（pHelper 1.0和pHelper 2.0）共转染HEK293T细胞，转染后8 h将培养基更换为DMEM完全培养基。培养48 h后，1000转/min离心5min，收集富含重组慢病毒的上清液，以0.45 μm滤器过滤病毒上清液，再经高速离心（4℃，50 000×g）浓缩和0.22 μm滤器过滤，得到高滴度的重组慢病毒浓缩液。采用逐孔倍比稀释计数法测定各组的病毒滴度［4］。

1.2.6 慢病毒感染靶细胞按2×104个细胞/孔，将SGC-7901接种于96孔板常规培养过夜。弃旧培养基，按100 μL/孔加入完全培养基稀释的重组慢病毒，再加入聚凝胺（终浓度为6 μg/mL），混匀后置于37℃、5%CO2培养箱中培养。感染后8 h，将培养基更换为不含聚凝胺的完全培养基。感染后72 h，荧光显微镜观察病毒感染效率。在96孔板培养1～2周后，可将细胞转至6 cm培养皿继续扩大培养，然后筛选稳定细胞克隆。

1.2.7 稳定细胞克隆的筛选取重组慢病毒感染的SGC-7901细胞，以胰蛋白酶消化后重悬，调整细胞浓度为50～60个细胞/mL，然后将细胞悬液按100 μL/孔接种于 96孔板。采用有限稀释法［5］挑选出单个细胞且能表达GFP的孔，将单克隆细胞移入24孔板连续培养，进行细胞扩增，最后在细胞培养瓶中进行扩大培养。

1.2.8 MTS法检测细胞增殖能力将各组SGC-7901细胞按1×104个细胞/孔接种于96孔板，37℃、5%CO2分别培养 1、2、3、4、5 d 后每孔加入 10 μL MTS，孵育4 h，之后置于酶标仪在490 nm波长处测定吸光度（A490）值。

1.3 统计学分析采用统计软件SPSS 16.0进行数据分析，计量资料采用均数和标准差（±s）描述，组间均数比较采用t检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BC002811 siRNA的筛选qPCR结果显示，siRNA-1组、siRNA-2组和siRNA-3组对SGC-7901细胞内BC002811的RNA干扰效率分别为87%、81%、66%；与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）；其中以 siRNA-1组的干扰效率最高。因此，后续实验选择siRNA-1设计BC002811shRNA。

2.2 BC002811 shRNA重组载体的鉴定插入序列与BC002811 shRNA目标序列完全一致，没有碱基插入、缺失、突变等异常，见图1。提示BC002811 shRNA慢病毒载体构建成功。

图1 BC002811 shRNA慢病毒载体的测序结果Figure 1 Identification images of the lentiviral vector carrying BC002811 shRNA

2.3 慢病毒包装及病毒滴度测定荧光显微镜下可见较强的绿色荧光，见图2。对照组、shRNA组的病毒滴度分别为4.5×108、3.7×108TU/mL，提示病毒已包装成功。

图2 显微镜下BC002811 shRNA慢病毒包装Figure 2 Fluorescence of HEK293T cells packaging BC002811 shRNA lentiviral vectors

2.4 建立稳定靶向干扰BC002811表达的SGC-7901胃癌细胞株shRNA组与对照组SGC-7901细胞在形态学上没有明显的差异，其生长状况良好，稳定表达绿色荧光，见图3。qPCR结果表明，shRNA组BC002811表达水平［（10%±1%）］较对照组明显降低［（100%±4%）］，差异有统计学意义（P＜0.01），提示稳定靶向干扰BC002811表达的SGC-7901胃癌细胞株构建成功。

2.5 稳定靶向干扰BC002811表达对SGC-7901细胞增殖能力的影响与对照组比较，shRNA组的SGC-7901细胞生长速度明显减慢，提示下调BC002811表达可抑制SGC-7901细胞增殖。见图4。

图3 荧光显微镜下观察稳定靶向干扰BC002811表达的SGC-7901胃癌细胞株Figure 3 Fluorescence and bright-field images of the gastric cancer SGC-7901 cell line with stable lncRNA BC002811 silencing by lentivirus-mediated RNA interference

图4 MTS法检测稳定干扰BC002811表达的SGC-7901细胞生长曲线Figure 4 Proliforation of SGC-7901 cells with stable lncRNA BC002811 silencing detected by MTS viability assay

3 讨 论

BC002811是一种基因定位于17号染色体长臂2区5带中的第1亚带、长约1686个核苷酸的lncRNA分子。我们以前的lncRNA芯片结果表明，BC002811在胃癌组织中呈异常高表达［3］。近期研究发现，BC002811表达水平与胃癌的微血管密度及淋巴结转移呈正相关［6］。但BC002811在胃癌中的生物学功能及其作用机制目前尚未见报道。

siRNA是一类片段长度为21～23个核苷酸的双链小分子RNA；通过以碱基互补配对方式结合靶基因的mRNA并使之降解，siRNA可在转录水平抑制靶基因表达［7］。由于具有特异性的基因调控能力，siRNA已经成为基因功能研究常用的一种分子工具。但siRNA在细胞内不能进行自主复制，在细胞分化过程中易被降解和稀释，其瞬时转染所导致的沉默效应持续时间短，无法实现对靶基因表达的稳定干扰［7-9］。shRNA是一类具有类似双链结构的短发夹状RNA分子。它是siRNA的前体，在细胞内经Dicer酶剪切加工后可形成siRNA，通过siRNA介导的特异性基因沉默效应发挥其RNA干扰作用［9］。与siRNA相比，shRNA可通过载体将其基因序列导入细胞，在细胞内实现自主复制和转录；因此，shRNA在细胞内的稳定性更高，作用维持时间更长［7，10］。鉴于此，本研究设计、合成了 3 个针对BC002811的siRNA序列。通过将这些siRNA序列转染胃癌SGC-7901细胞并进行qPCR检测，本研究筛选出最有效的BC002811干扰片段siRNA-1。以此作为基础，本研究在siRNA-1正义链和反义链基因序列之间引入一段由7个脱氧核苷酸所组成的Loop环序列，两端再分别加上BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点，设计、合成了针对BC002811的shRNA基因序列。

慢病毒是一类来源于人类免疫缺陷Ⅰ型（HIV-Ⅰ）病毒的载体。慢病毒感染宿主细胞后，可将其所携带的目的基因高效整合到宿主染色体中，在宿主细胞内实现外源性目的基因的持续稳定表达［11-12］。与腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒等其它的病毒载体相比，慢病毒具有免疫原性和细胞毒性低，感染效率高（分裂期细胞和非分裂期细胞均可感染），可容纳较大目的基因片段等优点，是携带干扰RNA的理想载体［11-13］。因此，本研究采用慢病毒作为载体来携带BC002811 shRNA，以实现在SGC-7901细胞内持续稳定地下调BC002811表达。

综上所述，本研究通过有限稀释法筛选和qPCR验证，我们建立了稳定靶向干扰BC002811表达的SGC-7901胃癌细胞株，为后续进一步探讨BC002811在胃癌中的功能及其作用机制奠定了基础。