髓源抑制性细胞通过抑制Th2细胞反应参与干燥综合征的实验研究

祁荆荆，张卓亚，伍树芳，黄赛赛，姚根宏

0 引 言

干燥综合征（Sjögren′s syndrome，SS）是一种复杂的自身免疫病，其发病机制至今尚不清楚，而且缺乏有效的治疗手段［1］。研究表明，先天免疫系统在SS发病早期发挥重要作用，而且SS患者中B细胞高度活化的机制也越来越明确［2-3］。对SS病理生理学和发病机制的深入研究，将有助于发现新的治疗策略。髓源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）具有一定的免疫抑制功能，可以对免疫反应进行多方面的调节［4］。一些研究提示MDSCs参与了多种自身免疫病［5-7］。我们前期研究发现，模型小鼠中MDSCs数量增加和功能改变，但MDSCs在SS中的具体作用机制有待于进一步探索。Th2细胞反应以分泌白细胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5、IL-9、IL-10及IL-13等为主要特征［8］。前期研究表明SS患者中存在Th1/2细胞失衡现象［9-10］。此外，MDSCs也可通过调节Th2细胞反应参与感染等疾病［11-12］。本研究中，我们通过向NOD小鼠过继移植MDSCs或清除其体内MDSCs的方法，观察小鼠SS样症状的变化，从而揭示MDSCs参与SS发病的具体机制，有望为临床治疗SS患者提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料雌性NOD小鼠30只，购自南京大学模式动物研究所，体重（21.5±0.8）g，实验动物合格证号：SYXK（苏）2014-0052。小鼠于南京大学医学院附属鼓楼医院动物中心SPF级环境下适应性喂养1周，温度（25±1）℃，相对湿度（35±5）%，每12小时明暗交替。Rat IgG2b、Ly-6G（Gr-1）（RB6-8C5）、antimouse CD11b-APC（Clone M1/70）、anti-mouse Gr1-PE（CloneRB6-8C5）、anti-mouseCD4-FITC（CloneGK1.5）和anti-mouseIL-4-PE（Clone11B11）（美国eBioscience公司）。佛波酯、离子霉素和brefeldin A（美国Enzo LifeScience公司）。小鼠IL-4的ELISA试剂盒（美国R&D Systems公司）。

1.2 方法

1.2.1 唾液流量检测小鼠麻醉后，腹腔注射毛果芸香碱（0.1 mg/kg体重），然后计算唾液流量（mL/15 min）。

1.2.2 颌下腺病理留取小鼠颌下腺组织，4%多聚甲醛固定过夜，后石蜡包埋和切片，然后切片进行HE染色，显微镜下观察淋巴细胞浸润并拍照。

1.2.3 流式细胞术检测MDSCs和Th2细胞小鼠处死后，留取脾，经过研磨、过滤和裂解红细胞后，制成单细胞悬液并计数。Ficoll法分离小鼠外周血单个核细胞，制成单细胞悬液并计数。检测MDSCs：细胞悬液中加入荧光抗体，anti-mouse CD11b-APC，anti-mouse Gr1-PE［13］，室温避光孵育15 min，加1 mL PBS洗涤细胞，离心弃上清，重悬细胞并于流式细胞仪上检测。取适当数量的细胞与荧光标记抗体共孵育，然后在流式细胞仪上检测。检测Th2细胞：先用20 ng/mL 佛波酯、1 μg/mL离子霉素及5 μg/mL brefeldin A于37℃培养箱中孵育4 h。然后，标记表面标志对应的流式抗体anti-mouse CD4-FITC，并破胞膜后标记胞膜内标志对应的流式抗体anti-mouse IL-4-PE［14］。采用 FlowJo软件分析结果。

1.2.4 过继移植MDSCs根据MDSCs分离和纯化试剂盒（Miltenyi Biotec）说明书，分离和纯化4周龄NOD小鼠（未出现SS样症状）脾MDSCs，制成单细胞悬液。将小鼠按随机数字表法分为PBS组（注射等量的PBS）和MDSCs组（移植MDSCs 1×106个/鼠），每组5只。

1.2.5 清除MDSCs将10周龄NOD小鼠按随机数字表法分为Rat IgG2b组和anti-Gr1组，每组5只，参照文献［15］方法，anti-Gr1组小鼠腹腔注射anti-Gr1抗体，250 μg/只，每3天注射1次，共5次。 Rat IgG2b组注射等量Rat IgG2b同型对照抗体。

1.2.6 ELISA检测根据ELISA试剂盒说明书，检测SS模型小鼠血浆IL-4水平。

1.3 统计学分析运用GraphPad Prism软件进行统计分析，定量资料以均数±标准差（±s）表示，两两组间之间比较采用t检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠MDSCs量变化比较流式结果显示，与PBS组相比，MDSCs移植组小鼠外周血及脾MDSCs显著增加（P＜0.05）。与 Rat IgG2b组相比，anti-Gr1组小鼠外周血及脾MDSCs显著降低（P＜0.05），见图1，表1。

2.2 过继移植MDSCs对小鼠SS样症状的影响HE染色结果显示，与PBS组相比，MDSC移植组颌下腺中淋巴细胞浸润灶增加，而且浸润面积明显增大，唾液流量显著降低（P＜0.05）。与Rat IgG2b组相比，anti-Gr1组小鼠颌下腺中淋巴细胞浸润灶减少，而且浸润面积明显减小，唾液流量显著增加（P＜0.05），见图2，表1。

图1 小鼠外周血和脾中MDSCs流式细胞图Figure 1 The representive flow cytometry of MDSCs in blood and spleen

图2 镜下观察小鼠颌下腺中淋巴细胞浸润情况（HE×100）Figure 2 Lymphocyte infiltration in submandibular glands of NOD mice under microscope（HE ×100）

表1 NOD小鼠唾液流量及外周血和脾MDSC的变化（±s）Table 1 Myeloid-derivedsuppressorcells(MDSC)intheperipheral blood and spleen and salivary flow of the non-obesediabeticmiceindifferentgroups（±s）

表1 NOD小鼠唾液流量及外周血和脾MDSC的变化（±s）Table 1 Myeloid-derivedsuppressorcells(MDSC)intheperipheral blood and spleen and salivary flow of the non-obesediabeticmiceindifferentgroups（±s）

与PBS组相比，*P＜0.05；与Rat IgG2b组相比，#P＜0.05

组别PBS组MDSC移植组Rat IgG2b组anti-Gr1组唾液流量（μL/15min）78.70±6.80 33.85±11.25*56.48±14.18 121.20±10.34#n 5 5 5 5外周血MDSC（×105）个1.54±0.14 5.47±1.54*1.53±0.12 0.35±0.16#脾MDSC（×105）个1.09±0.23 4.50±1.04*2.53±1.10 0.91±0.07#

2.3 MSDCs抑制NOD小鼠Th2细胞数量及活性与PBS组相比，MDSC移植组小鼠外周血及脾Th2细胞数量及血浆IL-4水平都显著降低（P＜0.05）。与Rat IgG2b组相比，anti-Gr1组小鼠外周血及脾Th2细胞数量则显著升高（P＜0.05），血浆 IL-4水 平 无 明 显 变 化（P＞0.05）。 见 图3，表2。

图3 小鼠外周血和脾中Th2细胞流式细胞图Figure 3 The representive flow cytometry of Th2 cells in blood and spleen

表2 NOD小鼠外周血和脾Th2细胞及血浆IL-4变化（±s）Table 2 Expression of Th2 cells in the peripheral blood and spleen and the IL-4 level in the plasma of the non-obese diabetic mice in different groups（xˉ± s）

表2 NOD小鼠外周血和脾Th2细胞及血浆IL-4变化（±s）Table 2 Expression of Th2 cells in the peripheral blood and spleen and the IL-4 level in the plasma of the non-obese diabetic mice in different groups（xˉ± s）

与PBS组相比，*P＜0.05；与Rat IgG2b组相比，#P＜0.05

组别PBS组MDSCs移植组Rat IgG2b组anti-Gr1组IL-4(pg/mL)18.98±1.50 13.60±0.54*18.08±1.20 16.65±2.84 n 5 5 5 5外周血Th2比例(%)0.67±0.13 0.16±0.07*0.55±0.09 0.92±0.10#脾Th2数目(×105个)1.20±0.26 0.57±0.29 0.73±0.18 1.39±0.12#比例(%)0.80±0.13 0.37±0.04*0.63±0.08 1.10±0.06#数目(×105个)1.57±0.22 0.88±0.05*1.43±0.20 2.42±0.03#

3 讨 论

尽管研究表明B细胞的异常活化是SS发病的一个重要特征，而且靶向B细胞治疗SS也已取得较好的效果。但是，SS并非仅仅是B细胞引起的疾病，其他免疫细胞也会参与其发病［3，16］。因此，有必要进一步研究SS的发病机制，为其临床治疗发掘更有效的治疗策略。我们研究发现，MDSCs通过抑制Th2细胞反应加重NOD小鼠SS症状。一些研究表明，Th2细胞可通过促进B细胞产生自身免疫抗体免疫球蛋白E［17］，并促进系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）及SS发病［18-19］。而本研究中，我们发现SS模型NOD小鼠外周血中MDSCs显著增加，IL-4水平显著降低。这可能由Th1/2细胞失衡及免疫细胞反应紊乱所致［10］。

流式细胞术是一种快速、准确、客观检测单个细胞多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术。细胞因子是由免疫细胞和一些非免疫细胞经刺激而合成分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。不同白细胞表面带有不同的分子标记。对于一些特定细胞，其内部会分泌特异性细胞因子，我们可以通过检测胞内细胞因子来对该类细胞进行鉴定。辅助性T细胞，简称Th细胞，能分泌多种细胞因子。常见Th细胞为Th1/2/17，相应的特异性标记为CD4和IFN-γ/IL-4/IL-17。静止的T、B细胞不产生或产生细胞因子极低，多数细胞因子必须在T细胞激活后才能分泌产生。活化T细胞信号激活剂常用的有佛波酯、离子霉素。免疫细胞激活后，再用高尔基体阻断剂阻断胞内蛋白转运系统，使细胞因子聚集在细胞质内。正常情况下，抗体无法穿过完整的细胞膜，故细胞内细胞因子无法被标记，因此标记表面标志抗体后要对细胞进行固定并破胞膜，即稳定细胞膜，保持细胞膜表面抗体与抗原结合的作用后使完整的细胞膜产生小孔以利于抗体进入细胞。目前，检测白细胞绝对数的方法很多，其中流式细胞术是使用最广泛且最有效的检测方法［20］。本研究中通过计数脾和外周血总白细胞，利用流式细胞术检测淋巴细胞百分比来计算Th2细胞亚群的绝对数。

MDSCs是骨髓来源的未成熟髓系细胞，其主要特征为通过ROS、NO、Arg-1等抑制T功能［5］。初期研究表明，MDSCs与肿瘤发生发展相关。近年来越来越多研究发现，MDSCs参与了自身免疫反应及自身免疫性疾病病程。据报道，MDSCs在SLE、类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）等多种自身免疫病中明显增多。增加MDSCs加重SLE及RA模型鼠症状，而删除 MDSCs则改善相应症状［13，21-22］。与本研究中MDSCs参与SS发病的作用一致。前期研究表明，MDSCs可通过促进Th1或Th17细胞反应，促进自身免疫病的发展，清除MDSCs后则可有效改善自身免疫病［13，22-27］。NOD小鼠是一种携带 MHCII IAg7分子的小鼠品系，其能自发出现胰腺淋巴细胞浸润，进而导致自身免疫性糖尿病即一型糖尿病［28］。研究发现，NOD小鼠于第4周开始，胰腺中出现T细胞浸润，但14周龄前并未出现胰腺功能损伤。NOD小鼠外分泌腺体中也发现有淋巴细胞浸润，于12周左右外分泌腺体中存在淋巴细胞浸润并导致唾液腺功能异常，是公认的SS样小鼠模型之一［29］。我们前期研究发现4周龄NOD小鼠并未出现SS样症状，但SS患者及8～12周龄SS样NOD小鼠外周血都有明显的MDSCs累积现象，推测MDSCs参与了SS发病，并发挥促炎作用。据报道，Th1/2细胞平衡在SS中也发挥重要作用，Th1细胞及其相关的细胞因子（IFN-γ和IL-12）在SS患者及SS样NOD小鼠中都有促炎作用［30-32］。而Th2细胞及其相关的细胞因子IL-4则可改善NOD小鼠包括SS症状在内的自身免疫疾病症状［31，33-34］和其他Th1细胞引起的自身免疫病［35-36］。本研究结果显示，SS模型小鼠中Th2细胞及其相关的IL-4都显著降低，而Th1细胞则无明显变化。据研究报道，Th17细胞其相关的细胞因子（IL-17A）可促进SS发病［37-39］。在本研究中，我们发现NOD小鼠外周血中Th17细胞显著增加，但NOD脾Th17细胞则无明显变化。总之，本研究发现，MDSCs可抑制Th2细胞，而不是Th1或Th17细胞，加重SS。这可能由于不同的炎性因子内环境造成了MDSCs在各种自身免疫病中表现出不同的作用机制所致［40］。

综上，MDSCs和Th2细胞反应在SS发病过程中发挥重要作用，而且，MDSCs可抑制Th2细胞反应促进SS发病，清除MDSCs则可促进Th2细胞反应抑制SS发病，靶向MDSCs和Th2细胞有望成为SS临床治疗的新手段。