蛇床子素对过氧化氢诱导下人表皮黑素细胞氧化损伤的影响*

李湘君 边 芳 吴爱萍 瞿平元

白癜风是皮肤科常见的一种难治性获得性色素脱失性皮肤病。表皮黑素细胞及角质形成细胞处理氧化应激的能力减弱，机体氧化-抗氧化系统失衡，这可能是导致黑素细胞功能障碍，引起白癜风发生的重要病因之一[1]。本研究采用过氧化氢诱导的黑素细胞体外凋亡模型检测蛇床子素对黑素细胞活性及树突的影响，并通过检测SOD和MDA的水平，初步探讨蛇床子素治疗白癜风的可能机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料M254培养基、人黑素细胞生长添加剂HMGS均购自美国Cascade公司；中性蛋白酶dispase购自广州威佳科技有限公司；胎牛血清FBS购自美国Gibco公司；二甲基亚砜DMSO、左旋多巴L-DOPA购自美国Sigma公司；MTS购自美国Promega公司；30%过氧化氢为国产分析纯。SOD及MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所。中药单体蛇床子素购于中国药品生物制品检定所。蛇床子素用DMSO助溶，-20℃冰箱避光保存，2周内使用，临用时用新鲜的培养基调至终浓度。

1.2 方法

1.2.1 黑素细胞的培养及鉴定取6～20岁健康男性包皮环切术后包皮组织，除去皮下组织后剪成宽约3 mm的细条，0.25%的Dispase酶4℃下消化18 h，分离表真皮，弃真皮，0.25%胰酶消化表皮5 min，反复吹打制成细胞悬液，200目细胞筛过滤，离心后以5×106个/ml密度接种培养。24 h后首次换液，培养至细胞80%～90%融合后传代。取第3～5代对数生长期细胞进行实验。L-DOPA染色鉴定所培养细胞为黑素细胞[2,3]。

1.2.2 不同浓度H2O2对人表皮黑素细胞的影响(MTS法)0.25%胰酶消化细胞，制成单细胞悬液，调整浓度为2.5×105/ml，接种于96孔培养板上，每孔100 μl。24 h后吸去培养液，用含浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mmol/L H2O2的新鲜培养液于37℃，5%CO2培养箱中培养24 h，每一浓度设5个复孔。培养结束后，分别加入MTS显色液20 μl，37 ℃继续孵育4 h后终止培养。应用酶标仪，在测量波长490 nm、参考波长630 nm下测定各孔光吸收值(A)，本实验重复3次。黑素细胞活力=(实验组A值/对照组A值)×100%。

1.2.3 蛇床子素对H2O2诱导下黑素细胞活性的影响根据预实验结果，浓度为20、40、80 μg/ml的蛇床子素具有较好的促黑素细胞生长作用，且呈浓度依赖性，故本实验选取上述浓度的蛇床子素作为实验浓度。当过氧化氢浓度为0.1 mmol/L、0.2 mmol/L时，对人表皮黑素细胞活性抑制作用不明显，但当其浓度增加至0.4 mmol/L时，可显著抑制黑素细胞活性(P<0.05)。故选择具有明显抑制细胞活性作用的最低过氧化氢浓度0.4 mmol/L，进行下一步实验。实验分组：对照组(仅添加完全培养基)、过氧化氢组(0.4 mmol/L)、蛇床子素高浓度组(80 μg/ml)、中浓度组(40 μg/ml)、低浓度组(20 μg/ml)，每组设4个复孔。接种细胞方法同上，培养24 h。细胞贴壁后倒去培养基，实验组每孔分别加入新鲜配制的高、中、低浓度蛇床子素完全培养基100 μl进行预处理，对照组、过氧化氢组仅添加完全培养基，继续培养24 h。倒去培养基，蛇床子素组及过氧化氢组分别加入新鲜配制的0.4 mmol/L过氧化氢培养基100 μl，对照组仅添加完全培养基，分别培养24 h。之后每孔分别加入20 μl MTS显色液，继续培养4 h后终止培养。用酶标仪测定各孔A值，方法同上。

1.2.4 蛇床子素对H2O2诱导下人表皮黑素细胞树突的影响实验分组同上，调整黑素细胞浓度为2.5×105/ml，接种于6孔细胞培养板中，每孔1 ml，培养24 h。细胞贴壁后，经高、中、低浓度蛇床子素预处理后加入0.4 mmol/L过氧化氢培养基方法同上，培养24 h后，在倒置相差显微镜下分别观察处理前后各组黑素细胞树突形态变化，并使用目镜标尺随机选取处理前后20个黑素细胞，记录各组细胞树突长度。根据公式：树突变化率=[(处理前黑素细胞树突长度-处理后黑素细胞树突长度)/处理前黑素细胞树突长度]×100%，记录各组树突变化率。实验重复3次[4]。

1.2.5 蛇床子素对H2O2诱导下人表皮黑素细胞内SOD及MDA的影响使用5个25 ml培养瓶培养细胞，实验分组同上，具体处理同上。培养结束后，分别收集上述对照组、过氧化氢组、蛇床子素高、中、低浓度组细胞，用PBS洗2遍，重悬于0.1%的PBS中，制成细胞数为2×106/ml的细胞悬液，反复冻融细胞3次，倒置相差显微镜观察细胞完全破碎后，以4000 r/min离心15 min，匀浆上清液做SOD及MDA测定。按照试剂盒所述方法，采用WST-1法，酶标仪于550 nm处测定OD值，并计算细胞内SOD活性。采用试剂盒介绍的TBA法，酶标仪于532 nm处测定OD值，测定细胞内MDA含量[5]。

2 结果

2.1 蛇床子素对H2O2诱导下黑素细胞活性的影响经完全随机设计资料的方差分析检验及多个样本均数间两两比较的SNK检验，结果显示过氧化氢组黑素细胞活力(50.83±2.58)%显著下降 (P<0.05)，蛇床子素高浓度组黑素细胞活力(71.40±2.46)%虽较对照组降低(P<0.05)，但显著高于过氧化氢组及蛇床子素中、低浓度组(P<0.05)。详见图1。

注：图1各组依次为对照组、过氧化氢组、蛇床子素高、中、低浓度组；与对照组比较，*P<0.05与过氧化氢组比较#P<0.05图1 蛇床子素对过氧化氢诱导下黑素细胞活力的影响

2.2 蛇床子素对H2O2诱导下黑素细胞树突的影响使用倒置相差显微镜观察处理前后黑素细胞形态学变化。处理前黑素细胞大多呈长梭形，有1～2支树突，树突细长，胞体较小，胞体周围可见明显光晕。随机选取处理前后20个黑素细胞并记录树突长度，根据公式计算树突变化率。结果显示过氧化氢组黑素细胞树突变化率(61.28±3.85)%较对照组(8.85±1.90)%显著升高(P<0.05)，显微镜下也观察到过氧化氢组细胞树突明显变短，甚至消失，且胞体呈现皱缩现象，部分细胞悬浮于培养基中，提示过氧化氢可明显缩短人表皮黑素细胞树突。蛇床子素高浓度组树突变化率(31.50±1.13)%及中浓度组(44.25±1.70)%显著低于过氧化氢组(P<0.05)。详见图2。

注：图2各组依次为对照组、过氧化氢组、蛇床子素高、中、低浓度组；与对照组比较，*P<0.05，与过氧化氢组比较，#P<0.05图2 蛇床子素对过氧化氢诱导下黑素细胞树突变化率影响

2.3 蛇床子素对H2O2诱导下黑素细胞内SOD活性及MDA含量的影响采用WST-1法检测各组黑素细胞内的超氧化物歧化酶(SOD)水平。结果显示：与对照组相比，过氧化氢组黑素细胞SOD活性(57.90±2.46)nmol·mgprot-1显著下降(P<0.05)。与过氧化氢组相比,蛇床子素高浓度组与中浓度组黑素细胞内SOD活性显著升高，分别为(89.24±2.81)nmol·mgprot-1和(81.11±2.88)nmol·mgprot-1(P<0.05)。采用TBA法检测各组细胞内的丙二醛(MDA)含量。结果显示过氧化氢组黑素细胞内MDA含量(3.10±0.19)nmol·mgprot-1较对照组显著上升(P<0.05)，而与过氧化氢组相比，蛇床子素高浓度组的细胞内MDA含量(2.39±0.19)nmol·mgprot-1显著降低(P<0.05)。详见表1。

表1 蛇床子素对过氧化氢诱导下黑素细胞内SOD活性及MDA含量的影响

注：与对照组比较，1)P<0.05；与过氧化氢组比较,2)P<0.05

3 讨论

白癜风是皮肤科常见的一种获得性色素脱失性皮肤病。据统计，目前全世界白癜风的人群患病率为0.5%～4%，我国的人群患病率为0.1%～2.7%，且有逐年增加的趋势[6]。在发病过程中，黑素细胞及角质形成细胞处理氧化应激的能力减弱与黑素细胞损伤及黑素合成受到抑制密切相关。有学者[7]在检测白癜风患者体内氧化应激水平时，发现白癜风患者红细胞中超氧化物歧化酶(SOD)和铜蓝蛋白水平明显降低，而脂质过氧化物丙二醛水平显著(MDA)升高，表明白癜风患者对氧自由基的清除能力下降。过氧化氢是活性氧自由基(ROS)的重要来源，可自由穿过生物膜，并能和金属离子如Cu+和Fe2+等发生芬顿反应而产生氧化活性更强的羟自由基。所以过氧化氢可能是造成黑素细胞损伤的重要原因[8，9]。

蛇床子在临床治疗白癜风取得较好疗效的中药配方制剂中出现频率较高。其主要活性成分为蛇床子素,化学名为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素。现代药理实验研究表明, 蛇床子素具有抗高血压、抗心律失常、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、抗骨质疏松症等功效[10]。祝双华等[11]研究发现蛇床子素对高糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞氧化应激损伤具有抗氧化保护作用。蛇床子素体外可直接清除氧自由基O2-·、羟自由基·OH，且同等剂量下效果优于维生素C[12]。罗增香等[4,13]应用蛇床子素作用于体外培养的黑素细胞，研究发现蛇床子素对人黑素细胞酪氨酸酶活性及黑素合成均有较强的促进作用,并且可促进黑素细胞树突的生成。

笔者通过试验检测蛇床子素对过氧化氢诱导下黑素细胞活性及树突的影响，结果显示：过氧化氢组黑素细胞活力显著下降(P<0.05)，蛇床子素高浓度组的黑素细胞活力虽低于对照组(P<0.05)，但显著高于过氧化氢组。过氧化氢组黑素细胞树突变化率较对照组显著升高(P<0.05)，蛇床子素高、中浓度组的黑素细胞树突变化率显著低于过氧化氢组(P<0.05)。提示在过氧化氢诱导的黑素细胞氧化损伤模型中，蛇床子素对黑素细胞的活性及树突的影响具有保护作用。此外，本研究检测了黑素细胞内MDA和SOD的水平，结果显示：过氧化氢组与对照组相比细胞内SOD活性显著下降(P<0.05)，MDA含量显著上升(P<0.05)。经80 μg/ml及40 μg/ml蛇床子素高、中浓度组的细胞内SOD活性较过氧化氢组显著升高(P<0.05)，蛇床子素高浓度组的细胞内MDA含量较过氧化氢组显著降低(P<0.05)。提示过氧化氢可显著降低黑素细胞内SOD水平及升高MDA水平，而蛇床子素可明显抑制过氧化氢的氧化应激作用，升高细胞内SOD水平，并降低MDA水平。通过上述试验，我们推测中药单体蛇床子素对黑素细胞的氧化应激损伤具有一定抗氧化保护作用，为蛇床子素治疗白癜风提供了一种新的作用机制，可成为临床上治疗此类疾病的一个新的作用靶点。