依托咪酯联合富氢液对脓毒症小鼠氧化应激、炎症损伤情况及血清HMGB1、MDA水平的影响分析

全宗宗，罗海鸣

(上海交通大学医学院附属第九人民医院 麻醉科，上海 201999)

脓毒症常由感染、严重创伤、大手术后、烧伤等诱发引起的机体免疫反应，其来势凶猛、进展迅速，极易引发脓毒症休克及多器官功能障碍，病死率高至28%～47%[1-2]。随着对脓毒症研究的深入，发现其生理机制错综复杂，包括宿主、炎症、免疫和异常凝血等多方面因素，伴随微循环、代谢以及细胞功能的改变。而过度的炎症反应仍是其最常见机制。依托咪酯是临床常用的静脉麻醉药物之一，有研究表明其可显著减少手术应激病人体内炎症因子的水平[3]。另外，近年来发现氢气有抗炎和抗氧化的效用，同时富氢液制备简单、价格便宜，且未发现不良反应[4]。血清高迁移率族蛋白B1(High mobility group box 1，HMGB1)是晚期的炎症介质，由其它炎症因子诱发产生，并正反馈加剧炎症反应[5]。丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是脂质最终的过氧化产物，其含量可反映体内氧自由基的水平，衡量氧化应激的损伤程度[6]。本次实验通过对脓毒症小鼠腹腔注射依托咪酯或者依托咪酯联合富氢液，观察其氧化应激损伤情况，并观察其对组织中HMGB1和MDA水平的影响，进一步探究脓毒症病人静脉所用麻醉药的有效性。

1 材料与方法

1.1 实验动物及其分组 选取72只由上海交通大学医学院动物中心所提供的雄性Balb/c小鼠，体重在15～20 g，许可证号为SCXK(沪)2018-0007。以随机数字表法分成四组，每组18例，依托咪酯组在脓毒症模型建立后予依托咪酯处理，联合组在脓毒症模型建立后予依托咪酯联合富氢液处理。本次实验动物处理方法均符合动物的伦理标准，并经本院动物管理委员会批准。

1.2 处理方法

1.2.1 药品及试剂 LPS(纯度98%，美国Sigmar公司，L2880)，使用前以无菌生理盐水溶解成浓度为2 mg/mL，-20 ℃保存；依托咪酯脂肪乳注射液(商品名：福尔利，江苏恩华药业股份有限公司，国药准字H20020511)；富氢液(氢气浓度0.6 mmol /L的生理盐水，上海碧云天生物公司)；IL6、IL10、HMGB1、MDA 酶联免疫吸附试剂盒(美国R&D公司)。

1.2.2 建立脓毒症模型 参照相关文献[7]采取小鼠腹腔注射LPS建立脓毒症模型，结合实验的预期结果，进行LPS剂量的确定。方法：实验前小鼠予禁食12 h、可自由饮水。以无菌的生理盐水溶解LPS为2 mg/mL，除正常对照组外均腹腔注射20 mg/kg的LPS，同时记录起始时间。

1.2.3 实验动物的给药 正常对照组：生理盐水0.2 mL腹腔注射；模型制备后0.5 h，依托咪酯组：依托咪酯10 mg/kg腹腔注射；联合组：依托咪酯10 mg/kg+富氢液5 mL/kg腹腔注射。

1.3 标本的采集和处理 在注射LPS后2、6 h每组分别取9只小鼠进行血液及肝、肾、肺组织标本的收集。血液标本：运用眼球摘除取血方法，收集血液约0.5 mL，以4 000 rpm离心10 min，取上层血清放置在-20 ℃的冰箱待测定。组织标本：将小鼠断颈处死，置于冰台上取其右肺下叶、右肾皮质及肝右叶，添加生理盐水，以玻璃匀浆器进行手工匀浆，将其制备为10%的组织匀浆，以3 000 rpm离心15 min，取上清液放置在-20 ℃冰箱待测。

1.4 观察指标

1.4.1 血清IL6及IL10的检测 运用酶联免疫吸附(ELISA)法测定4组小鼠血清中IL6及IL10的浓度，整个实验过程严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.2 组织HMGB1及MDA的检测 运用酶联免疫吸附(ELISA)法分别检测各组小鼠肝、肾、肺组织中HMGB1及MDA水平，整个实验过程严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 小鼠一般症状观察 正常对照组小鼠反应敏捷，精力旺盛，毛发光泽，活动能力、饮食、大小便均正常；注射LPS之后，小鼠出现寒战、呼吸加快、抱团取暖、活动低下、饮食减少、毛发凌乱耸立无光泽及解稀水样便，符合脓毒症的临床发病特点；给予依托咪酯或依托咪酯联合富氢液后，小鼠进食量、活动量明显增加，呼吸、精神、毛发等情况也有所好转，并以联合给药组效果更为明显。

2.2 4组小鼠血清中IL6及IL10含量比较 IL6含量：与正常对照组相比，脓毒症组2、6 h的IL6均显著升高，与脓毒症组相比，依托咪酯组及联合组2、6 h的IL6均显著降低，与依托咪酯组相比，联合组2、6 h的IL6显著降低，差异均具有统计学意义，P均<0.05；IL10含量：与正常对照组相比，脓毒症组2、6 h的IL10均显著降低，与脓毒症组相比，依托咪酯组及联合组2、6 h的IL10均显著升高，与依托咪酯组相比，联合组2、6 h的IL10显著升高，差异均具有统计学意义，P均<0.05(见表1)。

项目时间(h)正常对照组脓毒症组依托咪酯组联合组IL62616.06±4.7515.78±7.12107.09±7.92a 102.79±10.28a 66.18±3.35b74.06±7.58b43.25±3.22bc36.19±2.98bcIL1026295.65±26.58262.56±15.4982.04±20.74a87.24±21.45a230.94±24.41b189.98±17.98b278.34±20.35bc223.64±18.76bc

a：与正常对照组比较，P<0.05；b：与脓毒症组比较，P<0.05；c：与依托咪酯组比较，P<0.05。

2.3 4组小鼠肝组织中HMGB1、MDA含量比较 与正常对照组比较，脓毒症组6 h肝、肾、肺组织中HMGB1、MDA含量均明显升高，与脓毒症组比较，依托咪酯组及联合组6 h各组织的HMGB1、MDA含量明显降低，并且联合组的HMGB1、MDA含量显著低于依托咪酯组，均有统计学差异(P均<0.05，见表2)。

项目组织正常对照组脓毒症组依托咪酯组联合组HMGB1(μg/g)肝2.2±0.411.3±2.5a7.2±1.7b4.3±1.2bc肾2.4±0.510.5±2.3a6.9±1.3b4.0±0.8bc肺3.2±0.713.6±2.9a7.9±1.8b5.2±1.1bcMDA(nmol/mL)肝4.89±1.2218.88±2.01a13.28±1.49b8.52±1.44bc肾4.63±1.8215.92±2.11a10.99±1.33b5.74±2.13bc肺2.99±1.0315.73±1.57a10.25±1.75b5.13±2.21bc

a：与正常对照组比较，P<0.05；b：与脓毒症组比较，P<0.05；c：与依托咪酯组比较，P<0.05。

3 讨论

脓毒症是一种全身炎症性反应的综合征，常常与机体过度炎症反应相关，当宿主被病原体感染后，体内的促炎因子和介质被诱导生成及释放，相互影响并放大，形成炎症网络。虽然目前拥有先进的监护设备和诊疗技术，但脓毒症病情进展迅速，其发病率及病死率均高，仍然是医学界所面临的难题，也是近年来造成住院患者发生死亡的重要原因[8]。依托咪酯作为一种静脉麻醉药，有研究[6]表明在脓毒症的小鼠中可显著减轻炎性反应。此外，以氢气制备而成的富氢液则可有效减轻炎症反应及氧化应激[9]，这与张秉新等[10]研究氢气能有效降低脓毒症所致炎症因子释放及减轻脂多糖诱发炎症反应一致。因脓毒症主要由于革兰氏阴性菌产生的LPS刺激单核巨噬细胞，进一步释放IL1、TNF-α等大量的炎性介质，级联放大诱导全身炎症反应形成脓毒症。故本次实验以LPS制备脓毒症小鼠模型，观察依托咪酯联合富氢液对小鼠的炎症反应及氧化应激损伤情况。

当发生脓毒症时，体内会释放大量的炎症因子。IL-6属于促炎因子，常反映细胞因子的级联激活，与疾病的严重程度密切相关，可判断脓毒症的预后[11]。而IL-10则属于内源性的抗炎介质，常由内毒素及促炎因子诱导生成，可有效抑制炎症细胞分泌炎症因子，尤其可显著抑制由LPS诱发促炎介质的生成[12]。血清高迁移率族蛋白B1(HMGB1)属于晚期炎症介质，由其它炎性因子诱发产生[5]。有关研究[13]也表明脓毒症发生时能刺激IL-1β、TNF-α及HMGB等多种炎症因子释放。本次实验结果显示：2 h、6 h脓毒症组的IL6含量及6 h脓毒症组的HMGB1均较正常对照组升高，而依托咪酯组及联合组的均较脓毒症组降低，且联合组均显著低于依托咪酯组；2 h、6 h脓毒症组的IL10含量较正常对照组降低，而依托咪酯组及联合组的均较脓毒症组升高，且联合组均显著高于依托咪酯组。提示脓毒症发生时炎症因子IL6、HMGB1升高，而抗炎因子IL10降低，依托咪酯可有效降低IL6、HMGB1并升高IL10的含量，但联合富氢液则效果更显著。推测可能为以LPS制备小鼠脓毒症模型，LPS诱发促炎介质的生成，故脓毒症组小鼠血清中IL6、HMGB1显著高于正常对照组、IL10显著低于正常对照组，而依托咪酯可抑制促炎因子TNF-α及IL-6的生成[14]，富氢液中的H+也可降低TNF-α及IL-6水平抑制炎症反应[15]。二者相互协同进一步减少了IL6的生成及由此诱发的HMGB1的产生，并负反馈升高IL10的水平。

近年来研究发现脓毒症的重要发病机制还包括氧自由基的病理性增多、氧化及抗氧化的失衡[16]。当自由基与脂质相互作用引起过氧化化学反应时所形成的终末氧化产物MDA是由细胞膜性成分作及自由基组成，常表示机体的氧自由基生成及活性，间接反映过氧化应激的损伤情况，常用于其氧化应激水平的评估[17]。本次研究结果显示：6 h脓毒症小鼠肝肾肺组织MDA含量较正常对照组升高，而依托咪酯组及联合组的均较脓毒症组降低，且联合组均明显低于依托咪酯组。提示脓毒症发生时，出现氧化应激损伤，组织中MDA升高。依托咪酯可明显减轻氧化应激损伤降低MDA水平，但联合富氢液时效果更佳。药理研究表明依托咪酯不仅可以麻醉，同时还能扩张血管、减少机体耗氧量。相关研究证实依托咪酯有较强抗氧化作用[18]。富氢液所含H+可选择性清除氧自由基及活性氮并有效抑制氧化损伤及缓解缺血再灌注引起的器官损伤[19]。分析可能为二者联用，抗氧化作用叠加所致。

综上所述，依托咪酯联合富氢液可有效减少脓毒症小鼠血清中IL6及肝肺肾组织中HMGB1的含量、升高血清中IL10的含量以抑制炎性反应，并降低脓毒症小鼠肝肺肾组织中MDA的水平减轻氧化应激损伤。但本研究的实验结果尚需更大样本动物实验和临床实验进一步研究证实。